a*****a
发帖数: 32 | 1 看到文献说先将DNA和98%Formamide或者0.1M的NaOH 1:1 混合，然后95度30分钟，然后
跑6M的Urea Gel就能分开两条互补链，但是实际上不行，如果加热95度30分钟，
会导致跑胶出现N条带(N>6, 可能是因为Tm值介于75-80，过高，导致部分aneal)；
如果不加热的话，aneal在一起的双链DNA (一条30bp，一条40bp) 的band又占了主要。
有没有哪位高人知道如何能将两条互补的DNA链跑出单链的band出来？
万分感谢！ |
r********d
发帖数: 58 | 2 多长的链？
【在 a*****a 的大作中提到】
: 看到文献说先将DNA和98%Formamide或者0.1M的NaOH 1:1 混合，然后95度30分钟，然后
: 跑6M的Urea Gel就能分开两条互补链，但是实际上不行，如果加热95度30分钟，
: 会导致跑胶出现N条带(N>6, 可能是因为Tm值介于75-80，过高，导致部分aneal)；
: 如果不加热的话，aneal在一起的双链DNA (一条30bp，一条40bp) 的band又占了主要。
: 有没有哪位高人知道如何能将两条互补的DNA链跑出单链的band出来？
: 万分感谢！
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a*****a
发帖数: 32 | 3 一条30bp，一条40bp, 中间30bp为互补序列，Tm76度
【在 r********d 的大作中提到】
: 多长的链？
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s********n
发帖数: 2939 | 4 If you know the sequences of them, just synthesize them, :) |
M*****n
发帖数: 16729 | 5 even if they are 300bp 400bp it won't cost that much to have them
synthesized. |
a*****a
发帖数: 32 | 6 Separating the strands is for analysis.
【在 s********n 的大作中提到】
: If you know the sequences of them, just synthesize them, :)
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z*t
发帖数: 863 | 7 如果你怀疑Tm值过高的话，可以试试增大甲醛浓度，改变盐浓度降低Tm值。
【在 a*****a 的大作中提到】
: 看到文献说先将DNA和98%Formamide或者0.1M的NaOH 1:1 混合，然后95度30分钟，然后
: 跑6M的Urea Gel就能分开两条互补链，但是实际上不行，如果加热95度30分钟，
: 会导致跑胶出现N条带(N>6, 可能是因为Tm值介于75-80，过高，导致部分aneal)；
: 如果不加热的话，aneal在一起的双链DNA (一条30bp，一条40bp) 的band又占了主要。
: 有没有哪位高人知道如何能将两条互补的DNA链跑出单链的band出来？
: 万分感谢！
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s********n
发帖数: 2939 | 8 Do you know where I could order these 300-400 bp oligos? I only find IDT
could synthesize <=200 bp.
【在 M*****n 的大作中提到】
: even if they are 300bp 400bp it won't cost that much to have them
: synthesized.
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s********n
发帖数: 2939 | 9 So how did you get these products? PCR?
【在 a*****a 的大作中提到】
: Separating the strands is for analysis.
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a*****a
发帖数: 32 | 10 你是指增大formamide的浓度？
不知道这个会不会导电？会不会导致电泳的时候样品进胶不好？
【在 z*t 的大作中提到】
: 如果你怀疑Tm值过高的话，可以试试增大甲醛浓度，改变盐浓度降低Tm值。
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a*****a
发帖数: 32 | 11 As you said, synthesize them, and mix together...
【在 s********n 的大作中提到】
: So how did you get these products? PCR?
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s********n
发帖数: 2939 | 12 I am not clear why you want to separate them since you already have the
synthesized ones, just curious, :)
【在 a*****a 的大作中提到】
: As you said, synthesize them, and mix together...
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a********k
发帖数: 2273 | 13 genscript can do that, less than $0.5 per bp for large gene synthesis. We
had a 6kb gene synthesized by them, correct clone.
【在 s********n 的大作中提到】
: Do you know where I could order these 300-400 bp oligos? I only find IDT
: could synthesize <=200 bp.
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a********k
发帖数: 2273 | 14 they should be doing some biophysics. I know someone doing DNA penetration
and diffusion studies on lipid membranes.
【在 s********n 的大作中提到】
: I am not clear why you want to separate them since you already have the
: synthesized ones, just curious, :)
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z*t
发帖数: 863 | 15 对，我就是根据DNA Tm值来说，具体跑胶的话没有试过:)
【在 a*****a 的大作中提到】
: 你是指增大formamide的浓度？
: 不知道这个会不会导电？会不会导致电泳的时候样品进胶不好？
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s******s
发帖数: 13035 | 16 你加热以后怎么降温的？
49%的formamide很强了，差不多能降35C，加热95就算1k的都该分开了
【在 a*****a 的大作中提到】
: 看到文献说先将DNA和98%Formamide或者0.1M的NaOH 1:1 混合，然后95度30分钟，然后
: 跑6M的Urea Gel就能分开两条互补链，但是实际上不行，如果加热95度30分钟，
: 会导致跑胶出现N条带(N>6, 可能是因为Tm值介于75-80，过高，导致部分aneal)；
: 如果不加热的话，aneal在一起的双链DNA (一条30bp，一条40bp) 的band又占了主要。
: 有没有哪位高人知道如何能将两条互补的DNA链跑出单链的band出来？
: 万分感谢！
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w*****n
发帖数: 310 | 17 应该挺简单的,照这个配下buffer https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/
US/adirect/ab?cmd=catNavigate2&catID=603425 sample 95度3-5分钟，不用30分钟,
那是给大片段用的,200以下SSR之类的5分钟就够了,时间太长了引起降解(大片段掉俩bp
看不出来),确实会出N条带，冰上放一会儿(把泳道吹干净了),尥蹶子跑吧.然后染色,切
胶回收，（一条30bp，一条40bp是很大的差异了，一般差2bp就可以保证质量了）。
【在 a*****a 的大作中提到】
: 看到文献说先将DNA和98%Formamide或者0.1M的NaOH 1:1 混合，然后95度30分钟，然后
: 跑6M的Urea Gel就能分开两条互补链，但是实际上不行，如果加热95度30分钟，
: 会导致跑胶出现N条带(N>6, 可能是因为Tm值介于75-80，过高，导致部分aneal)；
: 如果不加热的话，aneal在一起的双链DNA (一条30bp，一条40bp) 的band又占了主要。
: 有没有哪位高人知道如何能将两条互补的DNA链跑出单链的band出来？
: 万分感谢！
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a*****a
发帖数: 32 | 18 用PCR仪设定95度30分钟，完成后立刻降温到4度
【在 s******s 的大作中提到】
: 你加热以后怎么降温的？
: 49%的formamide很强了，差不多能降35C，加热95就算1k的都该分开了
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c**********6
发帖数: 1173 | 19 你这样的条件足够强了，没有道理分不开
可能是你的urea gel不够好，我用过的invitrogen和biorad的precast gel的
denaturation效果都不如自己配置的8M的acrylamide gel好
然后，我觉得0.05M的NaOH 95C 30min 可能太强了，多条带有可能和DNA的degradation
有关吧
【在 a*****a 的大作中提到】
: 看到文献说先将DNA和98%Formamide或者0.1M的NaOH 1:1 混合，然后95度30分钟，然后
: 跑6M的Urea Gel就能分开两条互补链，但是实际上不行，如果加热95度30分钟，
: 会导致跑胶出现N条带(N>6, 可能是因为Tm值介于75-80，过高，导致部分aneal)；
: 如果不加热的话，aneal在一起的双链DNA (一条30bp，一条40bp) 的band又占了主要。
: 有没有哪位高人知道如何能将两条互补的DNA链跑出单链的band出来？
: 万分感谢！
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T**********t
发帖数: 1604 | 20 可以用PCR仪来加热，但是不应该用PCR仪来冷却。那个降温速度太慢了，还是会有部分
双链anneal上的。而且30分钟太长了，你只有30bp的互补区，加热5分钟基本就够了。
如果你用PCR仪加热，设定95度大于5分钟，六七分钟或者更长都行，等样品加热满了5
分钟之后，立即取出管子放到冰上，这样才叫snap cool。
【在 a*****a 的大作中提到】
: 用PCR仪设定95度30分钟，完成后立刻降温到4度
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s******s
发帖数: 13035 | 21 //nod. 正是我要说的。
5
【在 T**********t 的大作中提到】
: 可以用PCR仪来加热，但是不应该用PCR仪来冷却。那个降温速度太慢了，还是会有部分
: 双链anneal上的。而且30分钟太长了，你只有30bp的互补区，加热5分钟基本就够了。
: 如果你用PCR仪加热，设定95度大于5分钟，六七分钟或者更长都行，等样品加热满了5
: 分钟之后，立即取出管子放到冰上，这样才叫snap cool。
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k*******s
发帖数: 214 | 22
【在 a*****a 的大作中提到】
: 看到文献说先将DNA和98%Formamide或者0.1M的NaOH 1:1 混合，然后95度30分钟，然后
: 跑6M的Urea Gel就能分开两条互补链，但是实际上不行，如果加热95度30分钟，
: 会导致跑胶出现N条带(N>6, 可能是因为Tm值介于75-80，过高，导致部分aneal)；
: 如果不加热的话，aneal在一起的双链DNA (一条30bp，一条40bp) 的band又占了主要。
: 有没有哪位高人知道如何能将两条互补的DNA链跑出单链的band出来？
: 万分感谢！
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k*******s
发帖数: 214 | 23 用formamide最好，但一定要用高纯度的。建议用ABI的Hi-Di formamide (Cat#:
4311320).
DNA 样品沉淀干燥后用20ul formamide，然后96度2min，接着放冰上10分钟就可以。肯
定完全变性。
另外一个办法，就是1ul样品加上19ul formamide (最少9ul），96度2min，接着放冰上
10分钟就可以。
检测可以跑6% PAGE胶，TBE/TAE buffer.
【在 a*****a 的大作中提到】
: 看到文献说先将DNA和98%Formamide或者0.1M的NaOH 1:1 混合，然后95度30分钟，然后
: 跑6M的Urea Gel就能分开两条互补链，但是实际上不行，如果加热95度30分钟，
: 会导致跑胶出现N条带(N>6, 可能是因为Tm值介于75-80，过高，导致部分aneal)；
: 如果不加热的话，aneal在一起的双链DNA (一条30bp，一条40bp) 的band又占了主要。
: 有没有哪位高人知道如何能将两条互补的DNA链跑出单链的band出来？
: 万分感谢！
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a*****a
发帖数: 32 | 24 谢谢大家的指点，根据楼上各位的办法我都试了试，都挺好用的。非常感谢！
发信人: wangbin (wangbin), 信区: Biology
应该挺简单的,照这个配下buffer https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/
US/adirect/ab?cmd=catNavigate2&catID=603425 sample 95度3-5分钟，不用30分钟,
那是给大片段用的,200以下SSR之类的5分钟就够了,时间太长了引起降解(大片段掉俩bp看不
出来),确实会出N条带，冰上放一会儿(把泳道吹干净了),尥蹶子跑吧.然后染色,切胶回收，
（一条30bp，一条40bp是很大的差异了，一般差2bp就可以保证质量了）。
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发信人: ThisjobIwant (这活我来干), 信区: Biology
可以用PCR仪来加热，但是不应该用PCR仪来冷却。那个降温速度太慢了，还是会有部分
双链anneal上的。而且30分钟太长了，你只有30bp的互补区，加热5分钟基本就够了。
如果你用PCR仪加热，设定95度大于5分钟，六七分钟或者更长都行，等样品加热满了5
分钟之后，立即取出管子放到冰上，这样才叫snap cool。
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发信人: keytoiris (genemap), 信区: Biology
用formamide最好，但一定要用高纯度的。建议用ABI的Hi-Di formamide (Cat#:
4311320). DNA 样品沉淀干燥后用20ul formamide，然后96度2min，接着放冰上10分钟就可
以。肯定完全变性。另外一个办法，就是1ul样品加上19ul formamide (最少9ul），
96度2min，接着放冰上10分钟就可以。检测可以跑6% PAGE胶，TBE/TAE buffer.
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【在 a*****a 的大作中提到】
: 看到文献说先将DNA和98%Formamide或者0.1M的NaOH 1:1 混合，然后95度30分钟，然后
: 跑6M的Urea Gel就能分开两条互补链，但是实际上不行，如果加热95度30分钟，
: 会导致跑胶出现N条带(N>6, 可能是因为Tm值介于75-80，过高，导致部分aneal)；
: 如果不加热的话，aneal在一起的双链DNA (一条30bp，一条40bp) 的band又占了主要。
: 有没有哪位高人知道如何能将两条互补的DNA链跑出单链的band出来？
: 万分感谢！
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s********n
发帖数: 2939 | 25 Thanks. Actually I know these companies for gene synthesis. However, I am
looking for those who could synthesize oligos as long as possible. Now I
only know IDT could synthesize 200 bp oligos with confidence.
【在 a********k 的大作中提到】
: genscript can do that, less than $0.5 per bp for large gene synthesis. We
: had a 6kb gene synthesized by them, correct clone.
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