L***s
发帖数: 133 | 1 做了只转基因小鼠，lox-STOP-lox-gene-EGFP，EGFP是fuse在gene的C末端，target的
位置是ROSA26。
体外细胞试验很好, Cre转染后大量的GFP表达，功能也没问题，该基因不toxic。
好了，小鼠做好后，与Nestin-Cre line 杂交后，兴冲冲做了IHC (rabbit GFP Ab, invitrogen) ，结果很失望，发现GFP表达弱，且阳性细胞少；同样的Cre line 和ROSA26-YFP杂交后，同样的染色，YFP表达很强，阳性细胞很多。
帮忙分析一下原因
1. Fusion protein的问题？可能是fusion protein 表达量低？或是表达量可能并不那
么低，但在PFA fix时导致fusion protein被mask了，所以IHC看不到，证据是lox/lox
比lox/+的阳性细胞要多些。试了citrate buffer antigen retrieval (pH6, 95C,
15min)， 结果更差，一点阳性细胞也没有了。其他可行的antigen retrieval 方
法？
2. 因为target的位置都是R26，没有理由和R26YFP相差这么多。GFP和YFP在同样染色情
况下表达上能相差很多？
其他原因？Thanks |
j*********a
发帖数: 193 | 2 我试着回答一下好了：
我们公司做了很多这方面的研究，用不同的reporter (GFP, RFP etc)来做Cre老鼠。其
实最好的方法是用luciferase做reporter，用in vivo optical imaging筛选老鼠，非
常灵敏有效。
ＧＦＰ的问题就是波长短，和自发银光近似，抗体不特异，不知道你用的２抗是什么标
记的？如果和自发银光有干扰或者是ＧＦＰ在固定中活性disappear.. |
s******y
发帖数: 28562 | 3 我们也有类似经历，不过幸运的是我们转进去的只是一个单独的GFP
reporter, 看不到就拉倒了，反正有其他方法来知道哪个是transgenic老鼠.
我们的感觉是很多转进了老鼠内部的基因会有可能被体内的机构关起来不让
表达，或者表达大大降低。
你的情况，最好是这样：
１。把组织提出来做western blot
2. 用anti-GFP 来加强荧光。
我们一向都用Roche mouse anti-GFP，他家的抗体stock solution稀释得比较高，所以
用的时候不能稀释太多(所以比较不经用），但是特异性比较高。
invitrogen) ，结果很失望，发现GFP表达弱，且阳性细胞少；同样的Cre line 和
ROSA26-YFP杂交后，同样的染色，YFP表达很强，阳性细胞很多。
lox
【在 L***s 的大作中提到】
: 做了只转基因小鼠，lox-STOP-lox-gene-EGFP，EGFP是fuse在gene的C末端，target的
: 位置是ROSA26。
: 体外细胞试验很好, Cre转染后大量的GFP表达，功能也没问题，该基因不toxic。
: 好了，小鼠做好后，与Nestin-Cre line 杂交后，兴冲冲做了IHC (rabbit GFP Ab, invitrogen) ，结果很失望，发现GFP表达弱，且阳性细胞少；同样的Cre line 和ROSA26-YFP杂交后，同样的染色，YFP表达很强，阳性细胞很多。
: 帮忙分析一下原因
: 1. Fusion protein的问题？可能是fusion protein 表达量低？或是表达量可能并不那
: 么低，但在PFA fix时导致fusion protein被mask了，所以IHC看不到，证据是lox/lox
: 比lox/+的阳性细胞要多些。试了citrate buffer antigen retrieval (pH6, 95C,
: 15min)， 结果更差，一点阳性细胞也没有了。其他可行的antigen retrieval 方
: 法？
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f***4
发帖数: 886 | 4 这个很正常的。
检查一下你的TARGET载体构建和ROSA-YFP是不是一样，就是说整合在ROSA的位点是不是
一样。
现在存在的ROSA-YFP要比ROSA-GFP表达强很多倍，解释的原因很多，很多人同意就是整
合的位点不一样。
invitrogen) ，结果很失望，发现GFP表达弱，且阳性细胞少；同样的Cre line 和
ROSA26-YFP杂交后，同样的染色，YFP表达很强，阳性细胞很多。
lox
【在 L***s 的大作中提到】
: 做了只转基因小鼠，lox-STOP-lox-gene-EGFP，EGFP是fuse在gene的C末端，target的
: 位置是ROSA26。
: 体外细胞试验很好, Cre转染后大量的GFP表达，功能也没问题，该基因不toxic。
: 好了，小鼠做好后，与Nestin-Cre line 杂交后，兴冲冲做了IHC (rabbit GFP Ab, invitrogen) ，结果很失望，发现GFP表达弱，且阳性细胞少；同样的Cre line 和ROSA26-YFP杂交后，同样的染色，YFP表达很强，阳性细胞很多。
: 帮忙分析一下原因
: 1. Fusion protein的问题？可能是fusion protein 表达量低？或是表达量可能并不那
: 么低，但在PFA fix时导致fusion protein被mask了，所以IHC看不到，证据是lox/lox
: 比lox/+的阳性细胞要多些。试了citrate buffer antigen retrieval (pH6, 95C,
: 15min)， 结果更差，一点阳性细胞也没有了。其他可行的antigen retrieval 方
: 法？
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L***s
发帖数: 133 | 5 Thanks. 用过两种方法做IHC。
1。 rabbit GFP一抗，goat-anti-rabbit－488 二抗
2。 rabbit GFP一抗，goat-anti-rabbit－Biotin二抗，ABC（vectors), TSA（PE ）
2 结果明显要好于1，信号放大效果很明显，但是阳性细胞数量还是有限
对于ＧＦＰ在固定中活性disappear，有办法避免或复原吗？
【在 j*********a 的大作中提到】
: 我试着回答一下好了：
: 我们公司做了很多这方面的研究，用不同的reporter (GFP, RFP etc)来做Cre老鼠。其
: 实最好的方法是用luciferase做reporter，用in vivo optical imaging筛选老鼠，非
: 常灵敏有效。
: ＧＦＰ的问题就是波长短，和自发银光近似，抗体不特异，不知道你用的２抗是什么标
: 记的？如果和自发银光有干扰或者是ＧＦＰ在固定中活性disappear..
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L***s
发帖数: 133 | 6 因为要做很多形态学的东西，所以必须要染色work。
我用了GFP antibody，见上贴。试过几个，结果是Invitrogen 的rabbit anti-GFP明显
好于Aveslab的chicken GFP，invitrogen的mouse anti－GFP最差，非常弱。您感觉
Roche mouse anti-GFP和Invitrogen 的rabbit anti-GFP相比如何？
Thanks！
【在 s******y 的大作中提到】
: 我们也有类似经历，不过幸运的是我们转进去的只是一个单独的GFP
: reporter, 看不到就拉倒了，反正有其他方法来知道哪个是transgenic老鼠.
: 我们的感觉是很多转进了老鼠内部的基因会有可能被体内的机构关起来不让
: 表达，或者表达大大降低。
: 你的情况，最好是这样：
: １。把组织提出来做western blot
: 2. 用anti-GFP 来加强荧光。
: 我们一向都用Roche mouse anti-GFP，他家的抗体stock solution稀释得比较高，所以
: 用的时候不能稀释太多(所以比较不经用），但是特异性比较高。
:
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L***s
发帖数: 133 | 7 整合位置应该是一样的，只是我的TARGET载体外加了个promoter，本想提高表达，难道
是promoter被silence了？
你说的“现在存在的ROSA-YFP要比ROSA-GFP表达强很多倍，解释的原因很多，很多人同
意就是整合的位点不一样”很有意义，有相关文献出处吗？
谢楼上几位啦
【在 f***4 的大作中提到】
: 这个很正常的。
: 检查一下你的TARGET载体构建和ROSA-YFP是不是一样，就是说整合在ROSA的位点是不是
: 一样。
: 现在存在的ROSA-YFP要比ROSA-GFP表达强很多倍，解释的原因很多，很多人同意就是整
: 合的位点不一样。
:
: invitrogen) ，结果很失望，发现GFP表达弱，且阳性细胞少；同样的Cre line 和
: ROSA26-YFP杂交后，同样的染色，YFP表达很强，阳性细胞很多。
: lox
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L***s
发帖数: 133 | |
s******y
发帖数: 28562 | 9 Roche mouse anti-GFP 的信号还是很不错的，我只在WB用过invitrogen rabbit anti-
GFP,信号很强，但是杂带比较多。
但既然你是在老鼠里面做，用mouse anti-GFP的一个考量就是下面接着用的二抗
有可能会对血管和血细胞染色。所以你还是继续用rabbit 吧。
Abcam rabbit anti-GFP是我用过的最好的抗体，既特异，信号也强，唯一的缺点就是
特别贵。
【在 L***s 的大作中提到】
: 因为要做很多形态学的东西，所以必须要染色work。
: 我用了GFP antibody，见上贴。试过几个，结果是Invitrogen 的rabbit anti-GFP明显
: 好于Aveslab的chicken GFP，invitrogen的mouse anti－GFP最差，非常弱。您感觉
: Roche mouse anti-GFP和Invitrogen 的rabbit anti-GFP相比如何？
: Thanks！
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m****M
发帖数: 360 | 10 建议你做个qPCR看转录如何。这样你可以知道你的基因表达高低，插入的位点是否影响
转录。然后在讨论后面用什么方法提高信号。否则会浪费很多时间和精力 |
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L***s
发帖数: 133 | 11 Thanks
主要是想找个非rabbit的GFP抗体做double IHC，刚order了Abcam的chicken GFP
anti-
【在 s******y 的大作中提到】
: Roche mouse anti-GFP 的信号还是很不错的，我只在WB用过invitrogen rabbit anti-
: GFP,信号很强，但是杂带比较多。
: 但既然你是在老鼠里面做，用mouse anti-GFP的一个考量就是下面接着用的二抗
: 有可能会对血管和血细胞染色。所以你还是继续用rabbit 吧。
: Abcam rabbit anti-GFP是我用过的最好的抗体，既特异，信号也强，唯一的缺点就是
: 特别贵。
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z****u
发帖数: 1007 | 12 我们以前也遇到过同样问题。作为cre reporter的GFP在目标组织里根本看不到。但是
在sorting里能分辨出来，组织里只有上antibody. 分析原因是表达量不足，荧光不够
强，
后来解决办法一个是用H2BGFP作为reporter. 然后最近又找到了一个新的repoeter
mouse line ZsGreen fl/fl 在Jax有。 效果非常理想。荧光很强。 |
f***4
发帖数: 886 | 13 不好意思，顾着看八卦了。
现在我手头没有文献，明天我问问别人看看。但是我们的经验就是YFP强的多。
另外Abcam rabbit anti-GFP的抗体最好了。
Aves Labs Inc 的Chick GFP 也不错。
【在 L***s 的大作中提到】
: 整合位置应该是一样的，只是我的TARGET载体外加了个promoter，本想提高表达，难道
: 是promoter被silence了？
: 你说的“现在存在的ROSA-YFP要比ROSA-GFP表达强很多倍，解释的原因很多，很多人同
: 意就是整合的位点不一样”很有意义，有相关文献出处吗？
: 谢楼上几位啦
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n********k
发帖数: 2818 | 14 my experience is Cre-GFP fusion is horrible...but when use YFP reporter is
great...
【在 z****u 的大作中提到】
: 我们以前也遇到过同样问题。作为cre reporter的GFP在目标组织里根本看不到。但是
: 在sorting里能分辨出来，组织里只有上antibody. 分析原因是表达量不足，荧光不够
: 强，
: 后来解决办法一个是用H2BGFP作为reporter. 然后最近又找到了一个新的repoeter
: mouse line ZsGreen fl/fl 在Jax有。 效果非常理想。荧光很强。
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n********k
发帖数: 2818 | 15 also fusion-GFP sucks most of time...
invitrogen) ，结果很失望，发现GFP表达弱，且阳性细胞少；同样的Cre line 和
ROSA26-YFP杂交后，同样的染色，YFP表达很强，阳性细胞很多。
lox
【在 L***s 的大作中提到】
: 做了只转基因小鼠，lox-STOP-lox-gene-EGFP，EGFP是fuse在gene的C末端，target的
: 位置是ROSA26。
: 体外细胞试验很好, Cre转染后大量的GFP表达，功能也没问题，该基因不toxic。
: 好了，小鼠做好后，与Nestin-Cre line 杂交后，兴冲冲做了IHC (rabbit GFP Ab, invitrogen) ，结果很失望，发现GFP表达弱，且阳性细胞少；同样的Cre line 和ROSA26-YFP杂交后，同样的染色，YFP表达很强，阳性细胞很多。
: 帮忙分析一下原因
: 1. Fusion protein的问题？可能是fusion protein 表达量低？或是表达量可能并不那
: 么低，但在PFA fix时导致fusion protein被mask了，所以IHC看不到，证据是lox/lox
: 比lox/+的阳性细胞要多些。试了citrate buffer antigen retrieval (pH6, 95C,
: 15min)， 结果更差，一点阳性细胞也没有了。其他可行的antigen retrieval 方
: 法？
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l*****4
发帖数: 267 | 16 别只说antibody
也说说
其他可行的antigen retrieval 方法 |
s******y
发帖数: 28562 | 17 antigen retrieval 没有用的，因为估计根本就没有多少表达量。
因为有一次我们生气了，就把组织提出来做WB, 结果只看到了痕量的带。
估计组织上不喜欢GFP. 但是组织貌似对YFP没有问题。
不要问我为什么，我不能代表组织。
【在 l*****4 的大作中提到】
: 别只说antibody
: 也说说
: 其他可行的antigen retrieval 方法
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l*********i
发帖数: 332 | 18 你加的这个promoter很~~~重要， CAG? how long?
这帖子里的所有人，都基本上没有做ki mice的经验。都是什么乱七八糟的。
【在 L***s 的大作中提到】
: 整合位置应该是一样的，只是我的TARGET载体外加了个promoter，本想提高表达，难道
: 是promoter被silence了？
: 你说的“现在存在的ROSA-YFP要比ROSA-GFP表达强很多倍，解释的原因很多，很多人同
: 意就是整合的位点不一样”很有意义，有相关文献出处吗？
: 谢楼上几位啦
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l*********i
发帖数: 332 | 19 how in vitro experiments are done exactly? details.
what kind of cell, what exactly construct have you used?
invitrogen) ，结果很失望，发现GFP表达弱，且阳性细胞少；同样的Cre line 和
ROSA26-YFP杂交后，同样的染色，YFP表达很强，阳性细胞很多。
lox
【在 L***s 的大作中提到】
: 做了只转基因小鼠，lox-STOP-lox-gene-EGFP，EGFP是fuse在gene的C末端，target的
: 位置是ROSA26。
: 体外细胞试验很好, Cre转染后大量的GFP表达，功能也没问题，该基因不toxic。
: 好了，小鼠做好后，与Nestin-Cre line 杂交后，兴冲冲做了IHC (rabbit GFP Ab, invitrogen) ，结果很失望，发现GFP表达弱，且阳性细胞少；同样的Cre line 和ROSA26-YFP杂交后，同样的染色，YFP表达很强，阳性细胞很多。
: 帮忙分析一下原因
: 1. Fusion protein的问题？可能是fusion protein 表达量低？或是表达量可能并不那
: 么低，但在PFA fix时导致fusion protein被mask了，所以IHC看不到，证据是lox/lox
: 比lox/+的阳性细胞要多些。试了citrate buffer antigen retrieval (pH6, 95C,
: 15min)， 结果更差，一点阳性细胞也没有了。其他可行的antigen retrieval 方
: 法？
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G******O
发帖数: 189 | 20 搂主做的是转基因鼠。可能表达的部位不对
【在 l*********i 的大作中提到】
: 你加的这个promoter很~~~重要， CAG? how long?
: 这帖子里的所有人，都基本上没有做ki mice的经验。都是什么乱七八糟的。
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