f*****f
发帖数: 195 | 1 单独EGFP，用-20 C Methanol 固定时，发现很多细胞荧光变得极暗或消失（4%PFA正
常），是因为Methanol 消除了GFP的发光信号还是抽提了GFP蛋白？也就是说用GFP抗体
是否还能标记出来？ |
s******y
发帖数: 28562 | 2 Methanol 使得大部分蛋白变性了所以没有荧光了。用抗体还是能够标记出来的
【在 f*****f 的大作中提到】
: 单独EGFP，用-20 C Methanol 固定时，发现很多细胞荧光变得极暗或消失（4%PFA正
: 常），是因为Methanol 消除了GFP的发光信号还是抽提了GFP蛋白？也就是说用GFP抗体
: 是否还能标记出来？
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b******s
发帖数: 1089 | 3 固定剂的选择应当跟你的实验目的结合。methonal会使得蛋白变性而PFA只是可逆性得
交联蛋白。GFP变性了当然就看不到荧光了。用抗体应该还是可以看到荧光的，但是作
为细胞内蛋白的定位，还是应当用PFA。methonal对整个细胞的extraction太大，而且
会使核酸和蛋白发生聚集沉淀。
可能会有artifacts。所以ethonal和methonal只适用于组织形态学的实验。
【在 f*****f 的大作中提到】
: 单独EGFP，用-20 C Methanol 固定时，发现很多细胞荧光变得极暗或消失（4%PFA正
: 常），是因为Methanol 消除了GFP的发光信号还是抽提了GFP蛋白？也就是说用GFP抗体
: 是否还能标记出来？
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m*****u
发帖数: 15526 | 4 我用flow cytometry 测核内transcription factor就得用methanol处理。同时想看细
胞YFP荧光基本上就不可能了。如果哪个大虾有合适的protocol,不淬灭YFP,同时又能标
记上transcription factor的，麻烦提供一下。包子酬谢。有好的flow cytometry 用
的抗YFP荧光抗体，能标记上methanol处理过的细胞的也行。
【在 b******s 的大作中提到】
: 固定剂的选择应当跟你的实验目的结合。methonal会使得蛋白变性而PFA只是可逆性得
: 交联蛋白。GFP变性了当然就看不到荧光了。用抗体应该还是可以看到荧光的，但是作
: 为细胞内蛋白的定位，还是应当用PFA。methonal对整个细胞的extraction太大，而且
: 会使核酸和蛋白发生聚集沉淀。
: 可能会有artifacts。所以ethonal和methonal只适用于组织形态学的实验。
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P****o
发帖数: 172 | 5 We first fix GFP with 2% formaldehyde, followed by transcription factor
staining. This works for a bunch of TFs at our hands, but not sure whether
it will work for your case.
【在 m*****u 的大作中提到】
: 我用flow cytometry 测核内transcription factor就得用methanol处理。同时想看细
: 胞YFP荧光基本上就不可能了。如果哪个大虾有合适的protocol,不淬灭YFP,同时又能标
: 记上transcription factor的，麻烦提供一下。包子酬谢。有好的flow cytometry 用
: 的抗YFP荧光抗体，能标记上methanol处理过的细胞的也行。
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w********r
发帖数: 1431 | 6 你的实验可以用PFA固定么？
我之前用PFA处理细胞，加入PFA之后在显微镜下看，可以很清楚的看到GFP的信号就没
有了，
但是去掉PFA之后用PBS泡着，慢慢的GFP的信号就又恢复了，
挺好玩的，就像关灯开灯一样 |
f*****f
发帖数: 195 | 7 谢谢。不过很多GFP偶联的蛋白用Methanol 固定后荧光信号/定位好像并不会消失？
【在 s******y 的大作中提到】
: Methanol 使得大部分蛋白变性了所以没有荧光了。用抗体还是能够标记出来的
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f*****f
发帖数: 195 | 8 我倒没有直接在显微镜下看PFA影响，不过一般PFA 固定后用PBS洗后直接封片或IF标记
其它蛋白，荧光倒很正常
【在 w********r 的大作中提到】
: 你的实验可以用PFA固定么？
: 我之前用PFA处理细胞，加入PFA之后在显微镜下看，可以很清楚的看到GFP的信号就没
: 有了，
: 但是去掉PFA之后用PBS泡着，慢慢的GFP的信号就又恢复了，
: 挺好玩的，就像关灯开灯一样
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s******y
发帖数: 28562 | 9 大部分都会明显减弱，但是还是能勉强看见的，
如果看不见了那可能是你的蛋白表达量本来就不高。
【在 f*****f 的大作中提到】
: 谢谢。不过很多GFP偶联的蛋白用Methanol 固定后荧光信号/定位好像并不会消失？
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m*****u
发帖数: 15526 | 10 Thanks. I'll try. I used 4% formaldehyde treatment before TF staining. But the signal stil gone. Seems fixation/perm time is tricky
【在 P****o 的大作中提到】
: We first fix GFP with 2% formaldehyde, followed by transcription factor
: staining. This works for a bunch of TFs at our hands, but not sure whether
: it will work for your case.
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