b***a
发帖数: 147 | 1 从一个细胞株里提的蛋白，IgG做阴性对照，分别测蛋白A和蛋白B，用蛋白C做阳性对照。
结果是，input的lane里面都是干干净净，一点都没有，IgG的lane，可以见到重链，但
是向下的拖影很严重，蛋白A/B/C也是这样，拖影很严重，目的条带似有似无，第一次
做这几个蛋白，据说蛋白C是阳性对照，应该不错 的。
对了，A和B是核蛋白，我提的是总蛋白，就是提取的时候，用裂解液时间长一些，
vortex剧烈些。
觉得奇怪的是，为什么input里面干干净净，IP以后 反而有东西？这不是无中生有么？
我觉得从结果看，Western blot的过程应该没问题的，感觉是IP的问题，拖影可能是洗
脱的不够吧，可是这无中生有就没法解释了，要是一个抗体还可能是什么步骤错了，可
是三个抗体都这样，就奇怪了。。
盼高手指点一二。。。。 |
I*****y
发帖数: 6402 | 2 这有什么奇怪的？你的IP sample load了多少？是input量的多少倍？input最多也就lo
ad 几十微克的蛋白量吧？
蛋白C做阳性对照，是和A还是B结合？
照。
【在 b***a 的大作中提到】
: 从一个细胞株里提的蛋白，IgG做阴性对照，分别测蛋白A和蛋白B，用蛋白C做阳性对照。
: 结果是，input的lane里面都是干干净净，一点都没有，IgG的lane，可以见到重链，但
: 是向下的拖影很严重，蛋白A/B/C也是这样，拖影很严重，目的条带似有似无，第一次
: 做这几个蛋白，据说蛋白C是阳性对照，应该不错 的。
: 对了，A和B是核蛋白，我提的是总蛋白，就是提取的时候，用裂解液时间长一些，
: vortex剧烈些。
: 觉得奇怪的是，为什么input里面干干净净，IP以后 反而有东西？这不是无中生有么？
: 我觉得从结果看，Western blot的过程应该没问题的，感觉是IP的问题，拖影可能是洗
: 脱的不够吧，可是这无中生有就没法解释了，要是一个抗体还可能是什么步骤错了，可
: 是三个抗体都这样，就奇怪了。。
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z********8
发帖数: 818 | |
b***a
发帖数: 147 | 4 肯定是IP用的蛋白量多啊，差不多有1mg的总蛋白吧，你的意思是不是说IP起了一个
purify and concentrate的作用？ 你是说，因为input的量太少，所以测不出？
我是分别用A/B/C的抗体把它们pull down下来， 然后做下面的ChIP实验，现在只是试
试抗体行不行，结果出现这个问题，
蛋白C的抗体，据老板说是很不错的，所以作为阳性对照，判断实验过程没问题。
lo
【在 I*****y 的大作中提到】
: 这有什么奇怪的？你的IP sample load了多少？是input量的多少倍？input最多也就lo
: ad 几十微克的蛋白量吧？
: 蛋白C做阳性对照，是和A还是B结合？
:
: 照。
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s*********t
发帖数: 600 | 5 粘在beads上的 假阳性
pre clear下试试
【在 b***a 的大作中提到】
: 肯定是IP用的蛋白量多啊，差不多有1mg的总蛋白吧，你的意思是不是说IP起了一个
: purify and concentrate的作用？ 你是说，因为input的量太少，所以测不出？
: 我是分别用A/B/C的抗体把它们pull down下来， 然后做下面的ChIP实验，现在只是试
: 试抗体行不行，结果出现这个问题，
: 蛋白C的抗体，据老板说是很不错的，所以作为阳性对照，判断实验过程没问题。
:
: lo
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b***a
发帖数: 147 | 6 pre clear? 什么意思？
怎么做啊？没听过啊 |
f*c
发帖数: 2726 | 7 1, load多一点，或WB 用多一点抗体，至少input得看到才行啊,才能确定是哪个条带。
2，可以用light chain specific secondary antibody，降低IP background,也可以Preclear，就是ip加抗体前，先用igG 去掉一些background.
【在 b***a 的大作中提到】
: 肯定是IP用的蛋白量多啊，差不多有1mg的总蛋白吧，你的意思是不是说IP起了一个
: purify and concentrate的作用？ 你是说，因为input的量太少，所以测不出？
: 我是分别用A/B/C的抗体把它们pull down下来， 然后做下面的ChIP实验，现在只是试
: 试抗体行不行，结果出现这个问题，
: 蛋白C的抗体，据老板说是很不错的，所以作为阳性对照，判断实验过程没问题。
:
: lo
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b***a
发帖数: 147 | |
