H******d
发帖数: 13 | 1 在野生型蛋白的C末端融合GFP后，转入到knockout株系，knockout的表型完全恢复，融
合后的mRNA是正确的，也能用 GFP 抗体检测到期望大小的融合蛋白。本来以为能过一
个快乐的新年了。可是在confocal下根本就看不到荧光，郁闷死了。在线等大哥哥大姐
姐帮帮俺，有哪些可能的原因造成这种现象呢? 谢谢啦！也祝你们新年吉祥如意！ |
v*********d
发帖数: 382 | 2 Ectopic expression 经过几代后很容易就被silence掉了。
你的construct 如果是transient expression, 有没有GFP? 如果有
1，你现在的细胞株可以试一下染色，看看能不能检测到
2，从新做, 挑有GFP的单克隆， 再做个western 看看对不对
【在 H******d 的大作中提到】
: 在野生型蛋白的C末端融合GFP后，转入到knockout株系，knockout的表型完全恢复，融
: 合后的mRNA是正确的，也能用 GFP 抗体检测到期望大小的融合蛋白。本来以为能过一
: 个快乐的新年了。可是在confocal下根本就看不到荧光，郁闷死了。在线等大哥哥大姐
: 姐帮帮俺，有哪些可能的原因造成这种现象呢? 谢谢啦！也祝你们新年吉祥如意！
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n********k
发帖数: 2818 | 3 not that wierld at all, it is very common the fused protein is much weaker..
.worse case, you lose the signal, think about it, it is about fusion protein
folding and functionality. In this case fusion impact on GFP function but
not your protein function...so sometimes you can express higher...but that
could be a problem too as it could become toxic...could try fuse at
different ends etc...
【在 H******d 的大作中提到】
: 在野生型蛋白的C末端融合GFP后，转入到knockout株系，knockout的表型完全恢复，融
: 合后的mRNA是正确的，也能用 GFP 抗体检测到期望大小的融合蛋白。本来以为能过一
: 个快乐的新年了。可是在confocal下根本就看不到荧光，郁闷死了。在线等大哥哥大姐
: 姐帮帮俺，有哪些可能的原因造成这种现象呢? 谢谢啦！也祝你们新年吉祥如意！
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H******d
发帖数: 13 | 4 俺的是转基因株系，第二代，而且表现是稳定的，有几十个独立的株系。如果silence
掉的话，表型应该回归到knockout的表型，可是没有这样的情况。再说这么多独立株系
，不大可能全会沉默吧? 染色的话，没有做过，谢谢您的好主意。能否请您给我一个
protocol吗?
从新做，不太可能了，要好长时间，两三个月的样子。谢谢您！
【在 v*********d 的大作中提到】
: Ectopic expression 经过几代后很容易就被silence掉了。
: 你的construct 如果是transient expression, 有没有GFP? 如果有
: 1，你现在的细胞株可以试一下染色，看看能不能检测到
: 2，从新做, 挑有GFP的单克隆， 再做个western 看看对不对
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H******d
发帖数: 13 | 5 谢谢您的指点。俺觉得很可能是融合后，我的蛋白功能没有受到影响，但融合导致GFP
本身出了问题，尤其是我这种直接在生理条件下测试。实在没有办法的用CONFOCAL观察
的话，俺得用GFP抗体来搞传统的生化定位了。
..
protein
【在 n********k 的大作中提到】
: not that wierld at all, it is very common the fused protein is much weaker..
: .worse case, you lose the signal, think about it, it is about fusion protein
: folding and functionality. In this case fusion impact on GFP function but
: not your protein function...so sometimes you can express higher...but that
: could be a problem too as it could become toxic...could try fuse at
: different ends etc...
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C*******e
发帖数: 4348 | 6 插一句嘴
加linker了么？
silence
【在 H******d 的大作中提到】
: 俺的是转基因株系，第二代，而且表现是稳定的，有几十个独立的株系。如果silence
: 掉的话，表型应该回归到knockout的表型，可是没有这样的情况。再说这么多独立株系
: ，不大可能全会沉默吧? 染色的话，没有做过，谢谢您的好主意。能否请您给我一个
: protocol吗?
: 从新做，不太可能了，要好长时间，两三个月的样子。谢谢您！
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S******9
发帖数: 2837 | 7 我也做这个，直接看不见荧光
用1抗 anti-gfp， 然后2抗放大，就看到结果了。 |
s******y
发帖数: 28562 | 8 对
必须用抗体来抗GFP
直接能看见荧光的情况很少的，除了某些表达量非常高的蛋白
【在 S******9 的大作中提到】
: 我也做这个，直接看不见荧光
: 用1抗 anti-gfp， 然后2抗放大，就看到结果了。
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t******y
发帖数: 716 | 9 GFP 蛋白的可视性依赖于蛋白的表达量。你这个情况明显是因为GFP的融合蛋白表达太
低，显微镜下看不到。估计你的目标蛋白在细胞里的浓度是受到其他蛋白严格控制，所
以融合蛋白的表达量也受到控制。如果用IP，或western估计还是可以看到。 |
H******d
发帖数: 13 | 10 加了linker
【在 C*******e 的大作中提到】
: 插一句嘴
: 加linker了么？
:
: silence
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H******d
发帖数: 13 | 11 谢谢同路的您。
【在 S******9 的大作中提到】
: 我也做这个，直接看不见荧光
: 用1抗 anti-gfp， 然后2抗放大，就看到结果了。
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H******d
发帖数: 13 | 12 谢谢您指点。
【在 s******y 的大作中提到】
: 对
: 必须用抗体来抗GFP
: 直接能看见荧光的情况很少的，除了某些表达量非常高的蛋白
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H******d
发帖数: 13 | 13 谢谢您的建议。western是可以检测到，但IP还没有试。
【在 t******y 的大作中提到】
: GFP 蛋白的可视性依赖于蛋白的表达量。你这个情况明显是因为GFP的融合蛋白表达太
: 低，显微镜下看不到。估计你的目标蛋白在细胞里的浓度是受到其他蛋白严格控制，所
: 以融合蛋白的表达量也受到控制。如果用IP，或western估计还是可以看到。
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b******s
发帖数: 1089 | 14 放大后的荧光强度有多高，能很容易与背景相区别？
有没有比较的图片发给我看看？我也遇到很多GFP/YFP没有荧光的情形。
谢谢。
【在 S******9 的大作中提到】
: 我也做这个，直接看不见荧光
: 用1抗 anti-gfp， 然后2抗放大，就看到结果了。
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l**********1
发帖数: 5204 | 15 RE LZ
alternatively
you can try 2-Photon or Multi-photon Confocal Microscopy
pls refer
PLoS Biology 2005 paper:
htp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1149492/
more other protocols try go to
htp://swehsc.pharmacy.arizona.edu/exppath/micro/confocal.php
【在 H******d 的大作中提到】
: 谢谢您的建议。western是可以检测到，但IP还没有试。
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m*******u
发帖数: 173 | 16 LZ, Shake hands. Same problem in Arabi and tomato in my project. Our
collaborator met the same problem, because the fluorescence of GFP is weak.
He changed another type of GFP and with a translation enhancer in his
construct, then he got beautiful images. |
H******d
发帖数: 13 | 17 谢谢您提供的信息。
【在 l**********1 的大作中提到】
: RE LZ
: alternatively
: you can try 2-Photon or Multi-photon Confocal Microscopy
: pls refer
: PLoS Biology 2005 paper:
: htp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1149492/
: more other protocols try go to
: htp://swehsc.pharmacy.arizona.edu/exppath/micro/confocal.php
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H******d
发帖数: 13 | 18 谢谢您提供的信息！俺用的是35S驱动的eGFP。从mRNA水平看，表达量是相当高。当然
蛋白水平可能根本就不高。事实上用抗体检测有明确的信号但不是很强。您能不能告知
the element of the translation enhancer in his construct。
.
【在 m*******u 的大作中提到】
: LZ, Shake hands. Same problem in Arabi and tomato in my project. Our
: collaborator met the same problem, because the fluorescence of GFP is weak.
: He changed another type of GFP and with a translation enhancer in his
: construct, then he got beautiful images.
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m*******u
发帖数: 173 | 19 Tobacco etch virus translational leader (TL)
【在 H******d 的大作中提到】
: 谢谢您提供的信息！俺用的是35S驱动的eGFP。从mRNA水平看，表达量是相当高。当然
: 蛋白水平可能根本就不高。事实上用抗体检测有明确的信号但不是很强。您能不能告知
: the element of the translation enhancer in his construct。
:
: .
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L*******e
发帖数: 2153 | 20 in frame?
or after you cloned in, you generated a protease cleavage site or a stop codon? i would
sequence it first, then BLAST the linker sequence to see what comes up.
【在 H******d 的大作中提到】
: 在野生型蛋白的C末端融合GFP后，转入到knockout株系，knockout的表型完全恢复，融
: 合后的mRNA是正确的，也能用 GFP 抗体检测到期望大小的融合蛋白。本来以为能过一
: 个快乐的新年了。可是在confocal下根本就看不到荧光，郁闷死了。在线等大哥哥大姐
: 姐帮帮俺，有哪些可能的原因造成这种现象呢? 谢谢啦！也祝你们新年吉祥如意！
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l**********1
发帖数: 5204 | 21 You Sure?
>也能用 GFP 抗体检测到期望大小的融合蛋白
回复]
发信人: LifeHouse (Victoria), 信区: Biology
标 题: Re: weird GFP fusion
发信站: BBS 未名空间站 (Wed Jan 25 21:54:09 2012, 美东)
in frame?
or after you cloned in, you generated a protease cleavage site or a stop
codon? i would
sequence it first, then BLAST the linker sequence to see what comes up.
codon? i would
【在 H******d 的大作中提到】
: 在野生型蛋白的C末端融合GFP后，转入到knockout株系，knockout的表型完全恢复，融
: 合后的mRNA是正确的，也能用 GFP 抗体检测到期望大小的融合蛋白。本来以为能过一
: 个快乐的新年了。可是在confocal下根本就看不到荧光，郁闷死了。在线等大哥哥大姐
: 姐帮帮俺，有哪些可能的原因造成这种现象呢? 谢谢啦！也祝你们新年吉祥如意！
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l**********1
发帖数: 5204 | 22 De rien.
Plus another one paper:
htp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22203841
>Grey scale images are generated, reproducing the fluo- rescence intensity
in different tissue components (Figure 1). The estimated resolution is 0.5
μm in lateral direction and 1- 2 μm in the axial direction
full text link:
htp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3235701/pdf/DRP2012-810749.pdf
if LZ can not recognize 200 μm scale labeled GFP particle color signal just try at least 30 μm or more sensitive
likes above mentioned 2 μm scale GFP labeled particle color signal.
【在 H******d 的大作中提到】
: 谢谢您提供的信息。
|
H******d
发帖数: 13 | 23 谢谢您提供的建议！构建经过测序确认，而且在RNA水平上也确认正确，不存在您
提到的这两种可能性，另外用抗体能检测融合蛋白表达。
codon? i would
【在 L*******e 的大作中提到】
: in frame?
: or after you cloned in, you generated a protease cleavage site or a stop codon? i would
: sequence it first, then BLAST the linker sequence to see what comes up.
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H******d
发帖数: 13 | 24 谢谢您提供的详尽资料。您是大好人，吉人自有天相，祝福您！
scale.
university or nearby others.
of STED with the broadband
【在 l**********1 的大作中提到】
: De rien.
: Plus another one paper:
: htp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22203841
: >Grey scale images are generated, reproducing the fluo- rescence intensity
: in different tissue components (Figure 1). The estimated resolution is 0.5
: μm in lateral direction and 1- 2 μm in the axial direction
: full text link:
: htp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3235701/pdf/DRP2012-810749.pdf
: if LZ can not recognize 200 μm scale labeled GFP particle color signal just try at least 30 μm or more sensitive
: likes above mentioned 2 μm scale GFP labeled particle color signal.
|
l**********1
发帖数: 5204 | 25 Thanks so much for your 祝福
if your target scale is between 16 nm and 70 nm
still hope to use fluorescence imaging please go to
http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/31629913.html
8f and 9f
【在 H******d 的大作中提到】
: 谢谢您提供的详尽资料。您是大好人，吉人自有天相，祝福您！
:
: scale.
: university or nearby others.
: of STED with the broadband
|
l**********1
发帖数: 5204 | 26 Oui
but
Selection of expression vector is also VIP.
to little or no expression based on EST, MPSS, or microarray data using
reporter (GFP)
cited
>
The aim of our study was to examine the in vivo expression of many
Arabidopsis genes of unknown function that show little or no expression
based on EST, MPSS, or microarray data using reporter (GFP) genes driven by
their native promoter and thus learn something about their potential
function. In this study, we selected 627 Arabidopsis genes with unknown func
- tion, based on TIGR5 genome annotation,
full text link:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20687964
corresponding author lab link:
//www.jcvi.org/cms/about/bios/cdtown/
.
【在 m*******u 的大作中提到】
: LZ, Shake hands. Same problem in Arabi and tomato in my project. Our
: collaborator met the same problem, because the fluorescence of GFP is weak.
: He changed another type of GFP and with a translation enhancer in his
: construct, then he got beautiful images.
|
H******d
发帖数: 13 | 27 Thank you all for your suggestions!
Bingo! I succeeded in observing the GFP-localization of in nucleus.
The project seems in a good stage right now. Probably, this unknown function
protein is a DNA binding protein. Since completely unknown function and no
idea about the potential DNA target, I am thinking of that protein-DNA pull-
down assay might shed some sort of light. Actually I raised both functional
GFP and Myc tagged transgenic lines. If the tagged protein is labeled with
the affinity tag, the DNA-protein complex may be isolated using myc or GFP
antibody. In this case, the unknown DNA sequence bound by the protein could
be defined. Unfortunately, nobody around our research site have such hand-on
experience for this type of experiment. I am really grateful if you could
kindly give me some advices.
Thank you all again, guys! |
c**********e
发帖数: 230 | 28 哈哈, 那就CHIP-seq吧, 俺们这疙瘩都人都在干 |
S******9
发帖数: 2837 | 29 很容易区分开的
【在 b******s 的大作中提到】
: 放大后的荧光强度有多高，能很容易与背景相区别？
: 有没有比较的图片发给我看看？我也遇到很多GFP/YFP没有荧光的情形。
: 谢谢。
|
l**********1
发帖数: 5204 | 30 Agree with coffeecoffee said:
[回复]
[ 24 ]
发信人: coffeecoffee (咖啡咖啡), 信区: Biology
标 题: Re: weird GFP fusion
发信站: BBS 未名空间站 (Sun Feb 12 10:48:39 2012, 美东)
哈哈, 那就CHIP-seq吧, 俺们这疙瘩都人都在干
function
no
pull-
functional
could
on
【在 H******d 的大作中提到】
: Thank you all for your suggestions!
: Bingo! I succeeded in observing the GFP-localization of in nucleus.
: The project seems in a good stage right now. Probably, this unknown function
: protein is a DNA binding protein. Since completely unknown function and no
: idea about the potential DNA target, I am thinking of that protein-DNA pull-
: down assay might shed some sort of light. Actually I raised both functional
: GFP and Myc tagged transgenic lines. If the tagged protein is labeled with
: the affinity tag, the DNA-protein complex may be isolated using myc or GFP
: antibody. In this case, the unknown DNA sequence bound by the protein could
: be defined. Unfortunately, nobody around our research site have such hand-on
|
