b*******0
发帖数: 48 | 1 最近在做小鼠大脑切片的immunohistochemistry, 大脑是先心脏灌注PFA, 1:1 PFA :
sucrose 过夜，30% sucrose 3h.
OCT embedding. 然后cryostat 切片10um. 想染的蛋白主要是在cytoplasm。 先室温干
燥，然后extraction buffer 10 min, block 30min, Primary Ab 4oC ON. wash.
Secondary Ab . 试过Cy5 anti-rabbit, Alexa fluor 350 anti-rabbit. 好像都没有
荧光。
请问是Primary ab 浓度太低了，还是extraction buffer 不够啊。
谢谢。 |
w******y
发帖数: 2504 | 2 片子为什么不放在24孔板里染呢？我没有试过这个EXTRACTION BUFFER，不知道是干嘛
用的。一抗一般就是1:1000-- 1:5000吧。实在不行弄个阳性对照的看看。 |
n***w
发帖数: 2405 | 3 啥是extraction buffer。
看着觉着是permeablization不够。 |
b*******0
发帖数: 48 | 4
做的是fixed tissue,不是paraffin-embeded . crystat 切，直接用载玻片贴上的。然
后在humidified chamber里染。
【在 w******y 的大作中提到】
: 片子为什么不放在24孔板里染呢？我没有试过这个EXTRACTION BUFFER，不知道是干嘛
: 用的。一抗一般就是1:1000-- 1:5000吧。实在不行弄个阳性对照的看看。
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b*******0
发帖数: 48 | 5
其实就是permeabiztion 用的。0.5% triton-X ,后来试了直接加在block buffer里。
incubate 1h.还是不行。
【在 n***w 的大作中提到】
: 啥是extraction buffer。
: 看着觉着是permeablization不够。
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w******y
发帖数: 2504 | 6 我以前一直这么切，然后把脑片子漂在PBS里，然后再染的，没有问题。
【在 b*******0 的大作中提到】
:
: 其实就是permeabiztion 用的。0.5% triton-X ,后来试了直接加在block buffer里。
: incubate 1h.还是不行。
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n***w
发帖数: 2405 | 7 他就切了10um，也不一定要做floating staining。
你试试permeabilization时间长一点，包括block的时间也长一点。
或者你可以把你的片子用ice-cold methanol蘸一下看有没有改善。
还有就是你找个positive control确定你的抗体好使，且在脑子上好使。
【在 w******y 的大作中提到】
: 我以前一直这么切，然后把脑片子漂在PBS里，然后再染的，没有问题。
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g*****n
发帖数: 250 | 8 1。不要干燥。組织已经固定，没有必要干燥。
2。Retrieve antigen. 在Citrate buffer里煮几分钟，或其它方法。 |
