L*****o
发帖数: 48 | 1 以前从来没有研究过retina,实验室也刚涉及，只有我一个人开始摸石头过河。打算做
一些retina whole mount的染色，这几天刚刚试了试分离retina,分离倒是不难，可是
不知道怎么才能得到展平的retina？是分离后立刻对剪四刀，然后才whole mount吗？
还是whole mount之后才剪？剪完后，怎样才能平整的贴到载玻片上？我感觉轻轻一扯
就烂了，根本没法得到paper中展平漂亮的retina. 多谢指点！ |
z****u
发帖数: 1007 | |
L*****o
发帖数: 48 | 3 多谢啊。我也看过这个video，可还是有些不明白。
这个video说的是分离retinal pigment epithelium，而一般paper上的retina whole
mount staining应该只是neural retina，而不包括后面的eye cup吧？如何才能把那层
网状的neural retina展平贴片呢？
【在 z****u 的大作中提到】
: 去jove去搜索protocol.
: http://www.jove.com/video/2563/dissection-of-a-mouse-eye-for-a-
: 我就是在那里学会的。要剪成菊花瓣样子。多少都会有损坏的。
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n***w
发帖数: 2405 | 4 你所有的染色都应该在EP管里进行。此时，retina仍然是杯状（已经从RPE分离了）。
下面你要在dissection scope下面进行，用transfer pipette (前面的尖头剪掉)将液
体吸得差不多，然后把EP管倒置，这个时候retina应该就在盖子里，然后用镊子小心地
将其夹出，放到scope下的slide上，这时，retina应该还是呈现杯状, ganglion cell
layer up.
然后你要做的就是剪4下（一般四下就够了）。随便找个地方先剪一下，这个时候张力
减小，有两个地方就应该贴到slide上了，然后在对称的地方再剪一下，这个时候，一
般整个retina都贴上去了。
然后你在这两个切口90度的地方在各剪一下，所以四个口一般足够了。
至于peripheral的地方要弄平，我习惯直接用镊子，但是鉴于每个人小心程度没有办法
衡量，你也可以用soft brush，小心的弄平。
有什么问题可以再问我。 |
n***w
发帖数: 2405 | 5 可能语言描述不行，我就粗略地画了一下，希望能够帮助你理解。。。。。
cell
【在 n***w 的大作中提到】
: 你所有的染色都应该在EP管里进行。此时，retina仍然是杯状（已经从RPE分离了）。
: 下面你要在dissection scope下面进行，用transfer pipette (前面的尖头剪掉)将液
: 体吸得差不多，然后把EP管倒置，这个时候retina应该就在盖子里，然后用镊子小心地
: 将其夹出，放到scope下的slide上，这时，retina应该还是呈现杯状, ganglion cell
: layer up.
: 然后你要做的就是剪4下（一般四下就够了）。随便找个地方先剪一下，这个时候张力
: 减小，有两个地方就应该贴到slide上了，然后在对称的地方再剪一下，这个时候，一
: 般整个retina都贴上去了。
: 然后你在这两个切口90度的地方在各剪一下，所以四个口一般足够了。
: 至于peripheral的地方要弄平，我习惯直接用镊子，但是鉴于每个人小心程度没有办法
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m******5
发帖数: 1383 | 6 画得太Q了！
【在 n***w 的大作中提到】
: 可能语言描述不行，我就粗略地画了一下，希望能够帮助你理解。。。。。
:
: cell
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L*****o
发帖数: 48 | 7 Thanks a million! It's really helpful.
Another question about the fixation, do you recommend fix before the retina
separation or after? how long?
cell
【在 n***w 的大作中提到】
: 你所有的染色都应该在EP管里进行。此时，retina仍然是杯状（已经从RPE分离了）。
: 下面你要在dissection scope下面进行，用transfer pipette (前面的尖头剪掉)将液
: 体吸得差不多，然后把EP管倒置，这个时候retina应该就在盖子里，然后用镊子小心地
: 将其夹出，放到scope下的slide上，这时，retina应该还是呈现杯状, ganglion cell
: layer up.
: 然后你要做的就是剪4下（一般四下就够了）。随便找个地方先剪一下，这个时候张力
: 减小，有两个地方就应该贴到slide上了，然后在对称的地方再剪一下，这个时候，一
: 般整个retina都贴上去了。
: 然后你在这两个切口90度的地方在各剪一下，所以四个口一般足够了。
: 至于peripheral的地方要弄平，我习惯直接用镊子，但是鉴于每个人小心程度没有办法
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n***w
发帖数: 2405 | 8 我的standard protocol是：
1. enucleate the eyes
2. slit the cornea, put the eye in the fixative (usually 4% PFA), for 10min
3. remove cornea and lens and vitreous, and put the eyecup (retina+RPE+
sclera, etc) back to the fixative for about 30-40min. 1hour should also work
.
4. wash with PBS and dissect the retina from the eyecup.
5. put the retina to PBSTriton (1%) permeabilize
6. staining part
这个protocol适用于~95%的蛋白染色。
但是如果遇到一些比较tricky的东西，可能需要调整fixative，固定时间，
permeabilization等等。
我推荐分离之前fix，因为那样的话可以保证你的retina的morphology可以保持住，如
果直接分离，retina的杯状一团糟，最后做flatmount的时候要异常小心，即便如此，
也会有不少damage。
retina
【在 L*****o 的大作中提到】
: Thanks a million! It's really helpful.
: Another question about the fixation, do you recommend fix before the retina
: separation or after? how long?
:
: cell
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L*****o
发帖数: 48 | 9 非常有用！实在太感谢了！！
10min
work
【在 n***w 的大作中提到】
: 我的standard protocol是：
: 1. enucleate the eyes
: 2. slit the cornea, put the eye in the fixative (usually 4% PFA), for 10min
: 3. remove cornea and lens and vitreous, and put the eyecup (retina+RPE+
: sclera, etc) back to the fixative for about 30-40min. 1hour should also work
: .
: 4. wash with PBS and dissect the retina from the eyecup.
: 5. put the retina to PBSTriton (1%) permeabilize
: 6. staining part
: 这个protocol适用于~95%的蛋白染色。
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l**********1
发帖数: 5204 | 10 欧也跟着楼主赞一个
ntgxw不愧是US视网膜领域的德才兼备的人士。
Ps: 比那个蒼井空的所谓德艺双馨是一个太阳 一个月亮的light intensity 区别吧 啊
【在 L*****o 的大作中提到】
: 非常有用！实在太感谢了！！
:
: 10min
: work
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j**********l
发帖数: 7 | |
g*********5
发帖数: 2533 | 12 同赞。
希望苍老师前去慰问。
啊
【在 l**********1 的大作中提到】
: 欧也跟着楼主赞一个
: ntgxw不愧是US视网膜领域的德才兼备的人士。
: Ps: 比那个蒼井空的所谓德艺双馨是一个太阳 一个月亮的light intensity 区别吧 啊
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l**********1
发帖数: 5204 | 13 恩 干脆让她移居美国西海岸, 随了ntgxw大师了
作21世纪新新印象派5D 成像画作的模特儿 如何?
【在 g*********5 的大作中提到】
: 同赞。
: 希望苍老师前去慰问。
:
: 啊
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