f******g
发帖数: 1003 | 1 要用少量细胞，大约1000－4000个细胞，来做PCR，片段大约200bp.
请问大家有什么好的方法吗?好的kit能推荐一下吗?
谢谢 |
i*********0
发帖数: 915 | 2 你有email么？我可以给你一个protocol。 |
w*********d
发帖数: 82 | |
D*a
发帖数: 6830 | 4 你的pcr产物要干什么？
我们genotype都不提dna，化化细胞就行了。
曾经用genotype粗消化的dna做过测序，nested pcr，很干净。 |
l***y
发帖数: 638 | 5 这个数量的细胞pcr不难，简单点的用epicentre的quickextract solution，泡泡细胞就
可以直接用来pcr
【在 f******g 的大作中提到】
: 要用少量细胞，大约1000－4000个细胞，来做PCR，片段大约200bp.
: 请问大家有什么好的方法吗?好的kit能推荐一下吗?
: 谢谢
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s**2
发帖数: 1287 | 6 genotyping时用的细胞数大概是什么数量级的？没做过，请教一下。
【在 D*a 的大作中提到】
: 你的pcr产物要干什么？
: 我们genotype都不提dna，化化细胞就行了。
: 曾经用genotype粗消化的dna做过测序，nested pcr，很干净。
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D*a
发帖数: 6830 | 7 一片耳朵洞，消化以后还有一大片，肉眼看不出跟消化前有什么区别。
以前用老鼠尾巴，也差不多。
【在 s**2 的大作中提到】
: genotyping时用的细胞数大概是什么数量级的？没做过，请教一下。
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f******g
发帖数: 1003 | 8 测序，
【在 D*a 的大作中提到】
: 你的pcr产物要干什么？
: 我们genotype都不提dna，化化细胞就行了。
: 曾经用genotype粗消化的dna做过测序，nested pcr，很干净。
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f******g
发帖数: 1003 | 9 谢谢了
胞就
【在 l***y 的大作中提到】
: 这个数量的细胞pcr不难，简单点的用epicentre的quickextract solution，泡泡细胞就
: 可以直接用来pcr
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D*a
发帖数: 6830 | 10 这回答，真简洁
【在 f******g 的大作中提到】
: 测序，
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s**2
发帖数: 1287 | 11 谢谢回答。还是估摸不出来大概多少细胞数目。
【在 D*a 的大作中提到】
: 一片耳朵洞，消化以后还有一大片，肉眼看不出跟消化前有什么区别。
: 以前用老鼠尾巴，也差不多。
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f******g
发帖数: 1003 | 12 简洁，不简单
【在 D*a 的大作中提到】
: 这回答，真简洁
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D*a
发帖数: 6830 | 13 我也不知道啊，你大概试试吧，反正不用太多。
如果细胞少，关键是别按protocol上那样加那么多液体，少加点别把dna稀释了。
我的经验是这东西也没有规定必须怎么样
【在 s**2 的大作中提到】
: 谢谢回答。还是估摸不出来大概多少细胞数目。
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f******g
发帖数: 1003 | 14 能把你的试剂的配方或者catalog 发给我吗
谢谢
【在 D*a 的大作中提到】
: 你的pcr产物要干什么？
: 我们genotype都不提dna，化化细胞就行了。
: 曾经用genotype粗消化的dna做过测序，nested pcr，很干净。
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D*a
发帖数: 6830 | 15 http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/31538099.html
你的细胞少，少加点mix，减少一点digestion时间，比如2hours
先做做pcr 看看行不行。
pcr不行的话，一般是dna太稀了（mix加太多），或者digestion时间太长了。
用nested pcr测序
现在用的protocol是sigma Extract-N-Amp Tissue PCR Kit Catalog Numbers XNAT2,
XNAT2R
没测过序，但是pcr带挺漂亮的。想必配方也差不多。
【在 f******g 的大作中提到】
: 能把你的试剂的配方或者catalog 发给我吗
: 谢谢
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f******g
发帖数: 1003 | 16 谢
,
【在 D*a 的大作中提到】
: http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/31538099.html
: 你的细胞少，少加点mix，减少一点digestion时间，比如2hours
: 先做做pcr 看看行不行。
: pcr不行的话，一般是dna太稀了（mix加太多），或者digestion时间太长了。
: 用nested pcr测序
: 现在用的protocol是sigma Extract-N-Amp Tissue PCR Kit Catalog Numbers XNAT2,
: XNAT2R
: 没测过序，但是pcr带挺漂亮的。想必配方也差不多。
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a********k
发帖数: 2273 | 17 100细胞足够了，这是我的protocol，用genomic DNA把PCR条件摸好了基本100%成功率。
离心下细胞
加纯水20ul
用20ul枪头快速吹打20次
取2-5ul做PCR，20ul反应体系
PCR之前+95度五分钟，然后正常PCR的基础上+5cycles
Exo-SAP 30分钟，取5ul送测序。
【在 f******g 的大作中提到】
: 要用少量细胞，大约1000－4000个细胞，来做PCR，片段大约200bp.
: 请问大家有什么好的方法吗?好的kit能推荐一下吗?
: 谢谢
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w*****r
发帖数: 2061 | 18 搭车问PCR的问题，干细胞克隆筛选，几百个细胞，Viagen DirectPCR Lysis，只能P出
来几百bp的片段，1kb以上的PCR就是各种杂带，乙醇沉淀纯化也没有帮助
【在 f******g 的大作中提到】
: 要用少量细胞，大约1000－4000个细胞，来做PCR，片段大约200bp.
: 请问大家有什么好的方法吗?好的kit能推荐一下吗?
: 谢谢
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f******g
发帖数: 1003 | 19 谢谢，请问Exo-SAP什么意思？
率。
【在 a********k 的大作中提到】
: 100细胞足够了，这是我的protocol，用genomic DNA把PCR条件摸好了基本100%成功率。
: 离心下细胞
: 加纯水20ul
: 用20ul枪头快速吹打20次
: 取2-5ul做PCR，20ul反应体系
: PCR之前+95度五分钟，然后正常PCR的基础上+5cycles
: Exo-SAP 30分钟，取5ul送测序。
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f******g
发帖数: 1003 | 20 in vivo筛选吗？
需要1k的条带吗？
【在 w*****r 的大作中提到】
: 搭车问PCR的问题，干细胞克隆筛选，几百个细胞，Viagen DirectPCR Lysis，只能P出
: 来几百bp的片段，1kb以上的PCR就是各种杂带，乙醇沉淀纯化也没有帮助
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s******s
发帖数: 13035 | 21 pcr purification用的酶。一般pcr好了以后懒得纯化就要测序
的，就要加这个
【在 f******g 的大作中提到】
: 谢谢，请问Exo-SAP什么意思？
:
: 率。
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s******s
发帖数: 13035 | 22 杂带多的，用nested pcr. 大概就是先用外面一对引物p过，产物
纯化以后再用里面一对p
【在 w*****r 的大作中提到】
: 搭车问PCR的问题，干细胞克隆筛选，几百个细胞，Viagen DirectPCR Lysis，只能P出
: 来几百bp的片段，1kb以上的PCR就是各种杂带，乙醇沉淀纯化也没有帮助
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f******g
发帖数: 1003 | 23 谢谢
【在 s******s 的大作中提到】
: pcr purification用的酶。一般pcr好了以后懒得纯化就要测序
: 的，就要加这个
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a******a
发帖数: 283 | 24 这个好酷！
我准备尝试一下。我的是就是PCR最后读荧光数据，应该可以吧。
不用跑胶的。
我准备照你这个条件提取DNA，加REs消化下，然后就用来做PCR，看看能不能出来数据
。做ddPCR的。貌似应该可以把。
率。
【在 a********k 的大作中提到】
: 100细胞足够了，这是我的protocol，用genomic DNA把PCR条件摸好了基本100%成功率。
: 离心下细胞
: 加纯水20ul
: 用20ul枪头快速吹打20次
: 取2-5ul做PCR，20ul反应体系
: PCR之前+95度五分钟，然后正常PCR的基础上+5cycles
: Exo-SAP 30分钟，取5ul送测序。
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f******g
发帖数: 1003 | 25 有好结果，在这说一下，谢谢
【在 a******a 的大作中提到】
: 这个好酷！
: 我准备尝试一下。我的是就是PCR最后读荧光数据，应该可以吧。
: 不用跑胶的。
: 我准备照你这个条件提取DNA，加REs消化下，然后就用来做PCR，看看能不能出来数据
: 。做ddPCR的。貌似应该可以把。
:
: 率。
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a******a
发帖数: 283 | 26 我试了两次。一次结果和预计的差不多，10^4细胞有大约那么多的细胞基因数量测出来
；另外一次就差些，有可能丢细胞比较明显。
我的步骤就是：离心，加水20ul，p20枪头反复吸放20次，然后取3ul作pcr。
但是我的100个细胞的实验组只测到个位数的genomes数量 ：（
有没有建议？
另外如果从活体病理组织细胞取样提取DNA，能否使用同样protocol？有人做过吗？有
什么好的protocol吗？
这个好酷！
我准备尝试一下。我的是就是PCR最后读荧光数据，应该可以吧。
不用跑胶的。
我准备照你这个条件提取DNA，加REs消化下，然后就用来做PCR，看看能不能出来数据
。做ddPCR的。貌似应该可以把。
率。
【在 f******g 的大作中提到】
: 有好结果，在这说一下，谢谢
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r******g
发帖数: 600 | |
a********k
发帖数: 2273 | 28 我其实还有20-100细胞做RT-PCR的protocol，基本成功率也是很高的。
基本类似方法
主要变化是19uLH2O+1uL RNaseOUT
吹打破细胞
20uL加到clontech的EcoDry里面做RT
然后取4uL产物PCR
【在 a******a 的大作中提到】
: 这个好酷！
: 我准备尝试一下。我的是就是PCR最后读荧光数据，应该可以吧。
: 不用跑胶的。
: 我准备照你这个条件提取DNA，加REs消化下，然后就用来做PCR，看看能不能出来数据
: 。做ddPCR的。貌似应该可以把。
:
: 率。
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a********k
发帖数: 2273 | 29 病理组织更简单，直接加水95度，然后做PCR
如果细胞数量多，加Tris buffer+Protease K，消化1小时
100个细胞如果你液体少的话就直接1uL放PCR里面，PCR系统很牛逼的。
【在 a******a 的大作中提到】
: 我试了两次。一次结果和预计的差不多，10^4细胞有大约那么多的细胞基因数量测出来
: ；另外一次就差些，有可能丢细胞比较明显。
: 我的步骤就是：离心，加水20ul，p20枪头反复吸放20次，然后取3ul作pcr。
: 但是我的100个细胞的实验组只测到个位数的genomes数量 ：（
: 有没有建议？
: 另外如果从活体病理组织细胞取样提取DNA，能否使用同样protocol？有人做过吗？有
: 什么好的protocol吗？
:
: 这个好酷！
: 我准备尝试一下。我的是就是PCR最后读荧光数据，应该可以吧。
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a***y
发帖数: 19743 | 30 Phire direct PCR from Thermo
成功率高一点吧。普通taq可能被细胞里一些东西抑制。
【在 f******g 的大作中提到】
: 要用少量细胞，大约1000－4000个细胞，来做PCR，片段大约200bp.
: 请问大家有什么好的方法吗?好的kit能推荐一下吗?
: 谢谢
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f******g
发帖数: 1003 | 31 谢谢。
我这两天正在试quickExtraction solution 呢。
估计下周能看到结果
【在 a******a 的大作中提到】
: 我试了两次。一次结果和预计的差不多，10^4细胞有大约那么多的细胞基因数量测出来
: ；另外一次就差些，有可能丢细胞比较明显。
: 我的步骤就是：离心，加水20ul，p20枪头反复吸放20次，然后取3ul作pcr。
: 但是我的100个细胞的实验组只测到个位数的genomes数量 ：（
: 有没有建议？
: 另外如果从活体病理组织细胞取样提取DNA，能否使用同样protocol？有人做过吗？有
: 什么好的protocol吗？
:
: 这个好酷！
: 我准备尝试一下。我的是就是PCR最后读荧光数据，应该可以吧。
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f******g
发帖数: 1003 | 32 谢谢
【在 a********k 的大作中提到】
: 我其实还有20-100细胞做RT-PCR的protocol，基本成功率也是很高的。
: 基本类似方法
: 主要变化是19uLH2O+1uL RNaseOUT
: 吹打破细胞
: 20uL加到clontech的EcoDry里面做RT
: 然后取4uL产物PCR
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f******g
发帖数: 1003 | 33 谢谢
【在 a***y 的大作中提到】
: Phire direct PCR from Thermo
: 成功率高一点吧。普通taq可能被细胞里一些东西抑制。
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D*a
发帖数: 6830 | 34 那不就是我那个方子
【在 a********k 的大作中提到】
: 病理组织更简单，直接加水95度，然后做PCR
: 如果细胞数量多，加Tris buffer+Protease K，消化1小时
: 100个细胞如果你液体少的话就直接1uL放PCR里面，PCR系统很牛逼的。
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a******a
发帖数: 283 | 35 谢谢；）收藏了！
【在 a********k 的大作中提到】
: 我其实还有20-100细胞做RT-PCR的protocol，基本成功率也是很高的。
: 基本类似方法
: 主要变化是19uLH2O+1uL RNaseOUT
: 吹打破细胞
: 20uL加到clontech的EcoDry里面做RT
: 然后取4uL产物PCR
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a******a
发帖数: 283 | 36 像这些直接水解细胞用来做PCR的，样品稳定程度怎么样？caspases应该很容易被激活
分解掉DNA吧？ |
G*******a
发帖数: 414 | 37 95C人类细胞里的酶基本上都死翘翘了吧？
【在 a******a 的大作中提到】
: 像这些直接水解细胞用来做PCR的，样品稳定程度怎么样？caspases应该很容易被激活
: 分解掉DNA吧？
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a********k
发帖数: 2273 | 38 记得大多数步骤冰上操作。。。
【在 a******a 的大作中提到】
: 谢谢；）收藏了！
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d****i
发帖数: 2346 | 39
你好牛啊！这种方法稳定性如何？
96well的细胞是不是就太多了，一直想怎么样直接从96 well取细胞做realtime。现在
都是用24 well抽屉RNA，然后再做realtime。
【在 a********k 的大作中提到】
: 我其实还有20-100细胞做RT-PCR的protocol，基本成功率也是很高的。
: 基本类似方法
: 主要变化是19uLH2O+1uL RNaseOUT
: 吹打破细胞
: 20uL加到clontech的EcoDry里面做RT
: 然后取4uL产物PCR
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a******a
发帖数: 283 | 40 我做了一些，水解细胞，溶液直接加入pcr系统去。结果发现出现的都是假阳性信号。
当然我是读取taqman荧光信号来衡量pcr结果的，不是跑胶。
解释是，nucleases直接切掉probe上的fluorophores，所以出现的荧光信号都是假阳性。
那么对我来说，我这个系统（依靠读取荧光信号来判断pcr结果的）就最好先加tris
buffer和proteanse K来除掉nucleases，再水煮一下样品灭火protease K或者其他的酶
。之后加入PCR系统。
看看怎么样，这个方案可好？
【在 a********k 的大作中提到】
: 病理组织更简单，直接加水95度，然后做PCR
: 如果细胞数量多，加Tris buffer+Protease K，消化1小时
: 100个细胞如果你液体少的话就直接1uL放PCR里面，PCR系统很牛逼的。
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