y********8
发帖数: 23 | 1 我要在细胞中表达一个Fe-S cluster SAM的蛋白， 这个蛋白活性对oxygen极为敏感，
至少有氧的情况下在E.coli中没有任何活性。
第一次把此蛋白在细胞质中表达，没有酶活。想问大家如何有何方法让此蛋白在细胞中
有酶活？把它在mitochondria中表达， 是否有帮助？
谢谢！！！ |
j****n
发帖数: 3370 | 2 厌氧没法做？不然细胞里或多或少有氧气吧，加上你的是极为敏感。。。
ps haoqiwemxia蛋白，是pfl?
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【在 y********8 的大作中提到】
: 我要在细胞中表达一个Fe-S cluster SAM的蛋白， 这个蛋白活性对oxygen极为敏感，
: 至少有氧的情况下在E.coli中没有任何活性。
: 第一次把此蛋白在细胞质中表达，没有酶活。想问大家如何有何方法让此蛋白在细胞中
: 有酶活？把它在mitochondria中表达， 是否有帮助？
: 谢谢！！！
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y********8
发帖数: 23 | |
e****s
发帖数: 1125 | 4 这个估计只能在无氧条件下提，
还原态的Fe才是有活性的，O2是底物之一吧？你的铁已经是三价了，失去了被氧化的能
力，也就没有活性了。
如果没有无氧的条件，试试看提纯过程中加入适量DTT之类，同时把Buffer都Degas一下
。测活的时候再输入额外的O2。
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【在 y********8 的大作中提到】
: 我要在细胞中表达一个Fe-S cluster SAM的蛋白， 这个蛋白活性对oxygen极为敏感，
: 至少有氧的情况下在E.coli中没有任何活性。
: 第一次把此蛋白在细胞质中表达，没有酶活。想问大家如何有何方法让此蛋白在细胞中
: 有酶活？把它在mitochondria中表达， 是否有帮助？
: 谢谢！！！
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l****3
发帖数: 399 | |
j****n
发帖数: 3370 | 6 如果是在yeast等耗氧厉害的host做
可以直接加到厌氧管 密封好
少量氧气很快被消耗掉 就成厌氧环境了
用这个至少pfl可以功能表达 我们做过 其他类型protein的就不知道了
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【在 y********8 的大作中提到】
: yes
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