w*****8
发帖数: 193 | 1 我最近用TEV protease cleave我的蛋白中的TEV site，好几次都害得蛋白全部沉淀出
来。有没有人有相同的经验啊？难道是TEV加的太多了吗？我是1：20的加TEV |
j****n
发帖数: 3370 | 2 切fusion tag？是不是目标蛋白本身不太溶？ |
w*****8
发帖数: 193 | 3 嗯我要切掉fusion tag，MBP。目标蛋白应该还可以，是个有结构的蛋白。而且我做过
几次，只有一两次没有沉出来，其它几次都沉出来了。都不知道哪出了问题。
【在 j****n 的大作中提到】
: 切fusion tag？是不是目标蛋白本身不太溶？
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b******y
发帖数: 627 | 4 Try to use more and fresh DTT. Use more buffering reagents to counter the
acidity of DTT if it isn't pHed. Good luck! |
t*******o
发帖数: 516 | 5 有种可能是，你的fusion protein在低盐的情况下溶解度很好，但蛋白本身需要高盐，
所以TEV切了后蛋白沉淀。如果是这样的话，可以在加TEV后若干时间，比如4C, 三小时
，在蛋白还没沉淀前，dialysis到高盐里。我以前一个蛋白就是这么纯化出来的。
【在 w*****8 的大作中提到】
: 我最近用TEV protease cleave我的蛋白中的TEV site，好几次都害得蛋白全部沉淀出
: 来。有没有人有相同的经验啊？难道是TEV加的太多了吗？我是1：20的加TEV
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w*****8
发帖数: 193 | 6 谢谢你的建议。可是我切完后的蛋白是要长晶体的。不能dialysis到高盐里呀。所以我
的盐浓度只用了150mM。不过我切的时候蛋白浓度只有0.5mg/ml，就是怕溶解度不好沉
出来。我都trouble shooting很久了
【在 t*******o 的大作中提到】
: 有种可能是，你的fusion protein在低盐的情况下溶解度很好，但蛋白本身需要高盐，
: 所以TEV切了后蛋白沉淀。如果是这样的话，可以在加TEV后若干时间，比如4C, 三小时
: ，在蛋白还没沉淀前，dialysis到高盐里。我以前一个蛋白就是这么纯化出来的。
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w*****8
发帖数: 193 | 7 我的TEV里的reducing reagent是TCEP，而且也只有0.5mM，这个浓度够不够？
【在 b******y 的大作中提到】
: Try to use more and fresh DTT. Use more buffering reagents to counter the
: acidity of DTT if it isn't pHed. Good luck!
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t*******o
发帖数: 516 | 8 我也是做结晶的。 你这种情况多半是溶液不对。所谓高盐是相对TEV酶切的。比如
500mM盐。 你得先保证你的蛋白稳定了才能谈其他的对不对。楼上说的加DTT估计也有
帮助。0.5mM TCEP还是弱了点。
再说了，谁说高一点的盐不能结晶的？最普通的做法就是，screening时，set up好
droplet后，密封前，在所有的well solution里补加等浓度的盐，比如500mM.
【在 w*****8 的大作中提到】
: 谢谢你的建议。可是我切完后的蛋白是要长晶体的。不能dialysis到高盐里呀。所以我
: 的盐浓度只用了150mM。不过我切的时候蛋白浓度只有0.5mg/ml，就是怕溶解度不好沉
: 出来。我都trouble shooting很久了
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e****s
发帖数: 1125 | 9 有一个概念叫soluable inclusion body. 就是说，因为tag如GST, MBP本身有很好的溶
解性，有时候能提高融合蛋白的可溶性，但有时候，目标蛋白虽未完全折叠，因为tag
的存在也可溶，这就是soluable inclusion body. 若去处tag,蛋白就容易析出。
LZ遇见的可能是这一情况。为除tag的融合蛋白的活性检测过吗？ |
w*****8
发帖数: 193 | 10 这个建议很好呀。我试试DTT和高一点的盐吧。
【在 t*******o 的大作中提到】
: 我也是做结晶的。 你这种情况多半是溶液不对。所谓高盐是相对TEV酶切的。比如
: 500mM盐。 你得先保证你的蛋白稳定了才能谈其他的对不对。楼上说的加DTT估计也有
: 帮助。0.5mM TCEP还是弱了点。
: 再说了，谁说高一点的盐不能结晶的？最普通的做法就是，screening时，set up好
: droplet后，密封前，在所有的well solution里补加等浓度的盐，比如500mM.
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w*****8
发帖数: 193 | 11 我测过切完的蛋白的DSF，是fold的，还可以和inhibitor bind
tag
【在 e****s 的大作中提到】
: 有一个概念叫soluable inclusion body. 就是说，因为tag如GST, MBP本身有很好的溶
: 解性，有时候能提高融合蛋白的可溶性，但有时候，目标蛋白虽未完全折叠，因为tag
: 的存在也可溶，这就是soluable inclusion body. 若去处tag,蛋白就容易析出。
: LZ遇见的可能是这一情况。为除tag的融合蛋白的活性检测过吗？
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o*****4
发帖数: 1245 | 12 don't shake/rock your tube when you are doing digestion. |
e****s
发帖数: 1125 | 13 什么是DSF?
和inhibitor binding不能说明任何问题。Peptide有时候都能binding.
含MBP的fusion蛋白有活力吗？
【在 w*****8 的大作中提到】
: 我测过切完的蛋白的DSF，是fold的，还可以和inhibitor bind
:
: tag
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w*****8
发帖数: 193 | 14 就是Thermal shift assay。我测过MBP fusion 蛋白的酶活性，是active的
【在 e****s 的大作中提到】
: 什么是DSF?
: 和inhibitor binding不能说明任何问题。Peptide有时候都能binding.
: 含MBP的fusion蛋白有活力吗？
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w*****8
发帖数: 193 | 15 yes I did rock it during digestion. Why does this hurt?
【在 o*****4 的大作中提到】
: don't shake/rock your tube when you are doing digestion.
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