m*********r
发帖数: 49 | 1 正在纯化一个his-tag的蛋白。我想让蛋白结合到Ni柱上后用TEV protease剪切后收集
切下来的蛋白，我觉得这样比用immidazole洗脱纯度高，还省了以后再切tag的麻烦。
现在问题是，老板买了个qiagen的fast start kit (gravity flow的那种）， 里面的
Ni-agarose成型了之后像gel一样，不能被重新悬浮，我在加TEV protease洗脱的时候
（4C 过夜），溶液不能完全浸没Ni-agarose，跑胶后和immidazole洗脱的比较发现洗
脱效率很低，我怀疑是因为TEV protease不能很好地与Ni-agarose接触造成的。
请教下有什么推荐的解决方法么？别家卖的Ni-NT好像有那种纯化过程中一直都自由悬
浮的，
不知道哪家的好，或者我的TEV proteasejianqie剪切加洗脱的方案有设么可以改进的
地方？多谢！ |
k******0
发帖数: 1073 | 2 你的buffer有没有protease inhibitors，如PMSF， pepstatin等，它们是Tev
protease的抑制剂。有没有DTT，通常我们做Ni－NT不加DTT，好像TEV protease最好有
些DTT存在。还有，in column proteolysis
通常不如in solution digestion有效，多加些protease。 TEV protease特异性很强，
加多了也不怕。如果可以，还可以在20C水解，比4C有效。 |
m*********r
发帖数: 49 | 3 1.Protease inhibitor我只有在裂解细胞的时候加入的，不过在洗脱之前已经wash了几
次，洗脱的时候应该没什么残留了。
2. 我没加DTT,刚看了下别的protocol，貌似也推荐用1 mM DTT，我下次加入试试。（-
_- 第一次试没经验）
3. TEV加入量的问题也值得我多算计一下，多谢回复！
【在 k******0 的大作中提到】
: 你的buffer有没有protease inhibitors，如PMSF， pepstatin等，它们是Tev
: protease的抑制剂。有没有DTT，通常我们做Ni－NT不加DTT，好像TEV protease最好有
: 些DTT存在。还有，in column proteolysis
: 通常不如in solution digestion有效，多加些protease。 TEV protease特异性很强，
: 加多了也不怕。如果可以，还可以在20C水解，比4C有效。
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