j*********g
发帖数: 463 | 1 www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/nuc101
Nuclei Isolation Kit: Nuclei EZ Prep
到处都找不到recipe. 想自己配点，实在不想买（到货太慢）。 |
f*********9
发帖数: 258 | 2 最简单的方法Tris pH7.4 加NaCL 浓度都是25 mM 外加0.5% 的NP40， 提细胞核棒棒的
，细胞核裂解可以用RIPA 直接sonicate |
T****i
发帖数: 15191 | 3 re
【在 f*********9 的大作中提到】
: 最简单的方法Tris pH7.4 加NaCL 浓度都是25 mM 外加0.5% 的NP40， 提细胞核棒棒的
: ，细胞核裂解可以用RIPA 直接sonicate
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D***a
发帖数: 516 | 4 能再详细一些吗？谢谢。 比如是用votex，还是针头加注射器，还是dounce
homogenizer？
【在 f*********9 的大作中提到】
: 最简单的方法Tris pH7.4 加NaCL 浓度都是25 mM 外加0.5% 的NP40， 提细胞核棒棒的
: ，细胞核裂解可以用RIPA 直接sonicate
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j*********g
发帖数: 463 | 5 我买了他家的这个buffer了。我给客服写信了，他说他家的buffer有专利的，配方不公
开，他只能说是非离子型去垢剂，但是不是NP40，也不含Triton。
[在 florida2009 (福达) 的大作中提到：]
:最简单的方法Tris pH7.4 加NaCL 浓度都是25 mM 外加0.5% 的NP40， 提细胞核棒棒
的，细胞核裂解可以用RIPA 直接sonicate |
d****i
发帖数: 2346 | |
R****n
发帖数: 708 | 7 搭车问一下，这个细胞核可以直接用MNase or DNaseI 处理跑agarose?
【在 f*********9 的大作中提到】
: 最简单的方法Tris pH7.4 加NaCL 浓度都是25 mM 外加0.5% 的NP40， 提细胞核棒棒的
: ，细胞核裂解可以用RIPA 直接sonicate
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c********b
发帖数: 363 | 8 MNase的话加点Ca应该可以，在植物细胞里面试过的。DNase I的话RIPA的盐浓度高了点。
【在 R****n 的大作中提到】
: 搭车问一下，这个细胞核可以直接用MNase or DNaseI 处理跑agarose?
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R****n
发帖数: 708 | 9 多谢！其实我也刚定了那个kit,要是时间太长，就自己配buffer吧
点。
【在 c********b 的大作中提到】
: MNase的话加点Ca应该可以，在植物细胞里面试过的。DNase I的话RIPA的盐浓度高了点。
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R****n
发帖数: 708 | 10 核提出来了，有几个问题
1）trypen blue染色下很多都聚团，如果使劲吹打就破碎了。
2）因为聚团所以没法计算核的浓度，CTL和KD怎么相对定量?
3) MNase大概放多少细胞核？
我基本是这个protocl
http://www.nature.com/nmeth/journal/v2/n9/abs/nmeth0905-719.html
点。
【在 c********b 的大作中提到】
: MNase的话加点Ca应该可以，在植物细胞里面试过的。DNase I的话RIPA的盐浓度高了点。
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R****n
发帖数: 708 | |
c********b
发帖数: 363 | 12 我做的植物细胞，在植物里面一般都是说取多少gram的叶子或者苗做起始材料，到了核
这一步不像你们那样再计数的，所以我也不知道该怎么回答。我一般放NEB的MNase，5-
10g的起始材料，拿到核以后放5000-10000 gel units。
我做RNA-IP是拿特异抗体处理，非特异抗体做negative control。如果是一般的WB，
histone和ADK kinase分别做marker。如果是RNA，就是U2或者U6。
【在 R****n 的大作中提到】
: 核提出来了，有几个问题
: 1）trypen blue染色下很多都聚团，如果使劲吹打就破碎了。
: 2）因为聚团所以没法计算核的浓度，CTL和KD怎么相对定量?
: 3) MNase大概放多少细胞核？
: 我基本是这个protocl
: http://www.nature.com/nmeth/journal/v2/n9/abs/nmeth0905-719.html
:
: 点。
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R****n
发帖数: 708 | 13 今天简单一下，虽然不好看，但是意思出来了，似乎核有点结块问题不大。见图，还有
几个问题。
1）我准备后续做southern,MNase处理后，要不要加RNase A 和 proteinase K,原有
MNase buffer行不行？因为lane 2-5，band之间有smear.
2) 1%的胶跑出去了，理想是多大浓度？
非常感谢！
5-
【在 c********b 的大作中提到】
: 我做的植物细胞，在植物里面一般都是说取多少gram的叶子或者苗做起始材料，到了核
: 这一步不像你们那样再计数的，所以我也不知道该怎么回答。我一般放NEB的MNase，5-
: 10g的起始材料，拿到核以后放5000-10000 gel units。
: 我做RNA-IP是拿特异抗体处理，非特异抗体做negative control。如果是一般的WB，
: histone和ADK kinase分别做marker。如果是RNA，就是U2或者U6。
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d****i
发帖数: 2346 | 14
应该就是NP40.
https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/General_
Information/1/ascb_1999_ned_poster_pdf.pdf
0.1%NP40即可。
【在 j*********g 的大作中提到】
: 我买了他家的这个buffer了。我给客服写信了，他说他家的buffer有专利的，配方不公
: 开，他只能说是非离子型去垢剂，但是不是NP40，也不含Triton。
: [在 florida2009 (福达) 的大作中提到：]
: :最简单的方法Tris pH7.4 加NaCL 浓度都是25 mM 外加0.5% 的NP40， 提细胞核棒棒
: 的，细胞核裂解可以用RIPA 直接sonicate
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j*********g
发帖数: 463 | 15 没错，我看了你贴的poster，确实就是NP40（也叫Igepel CA630）。
Sigma坑人啊，这个buffer卖的不便宜。
Sigma的客服回信说
Hello
Thank you for contacting Sigma-Aldrich Technical Service, now MilliporeSigma
- the life science business of Merck KGaA, Darmstadt, Germany.
The exact formulation of the lysis buffer in the NUC101 - Nuclei Isolation
Kit: Nuclei EZ Prep is withheld as proprietary information. We can say that
it is a non-ionic detergent that does not contain reducing agents. And it
does not contain Triton or any protease inhibitors.
Jon-Erik Hansen
Technical Service Scientist, North America Technical Service
【在 d****i 的大作中提到】
:
: 应该就是NP40.
: https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/General_
: Information/1/ascb_1999_ned_poster_pdf.pdf
: 0.1%NP40即可。
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d****i
发帖数: 2346 | 16
MilliporeSigma
that
要卖钱就不能给你说实话啊。
【在 j*********g 的大作中提到】
: 没错，我看了你贴的poster，确实就是NP40（也叫Igepel CA630）。
: Sigma坑人啊，这个buffer卖的不便宜。
: Sigma的客服回信说
: Hello
: Thank you for contacting Sigma-Aldrich Technical Service, now MilliporeSigma
: - the life science business of Merck KGaA, Darmstadt, Germany.
: The exact formulation of the lysis buffer in the NUC101 - Nuclei Isolation
: Kit: Nuclei EZ Prep is withheld as proprietary information. We can say that
: it is a non-ionic detergent that does not contain reducing agents. And it
: does not contain Triton or any protease inhibitors.
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R****n
发帖数: 708 | 17 这个溶液保存提取的核怎么样？
【在 f*********9 的大作中提到】
: 最简单的方法Tris pH7.4 加NaCL 浓度都是25 mM 外加0.5% 的NP40， 提细胞核棒棒的
: ，细胞核裂解可以用RIPA 直接sonicate
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l*****7
发帖数: 8463 | 18 这么简单的问题需要问吗？
查查文献就能找出来原始或改良配方。
N decades 前都是自己配自用， 根本不需要买。 |
S**********e
发帖数: 620 | 19 这个实验要做好确实需要高超的技巧，比方说，np40浓度，温度，时间，甚至细胞浓度
确实需要严格控制。否则最后结果可能多多少少有交叉污染，即使公司卖的也不是每一
个都有很少的细胞核细胞浆交叉污染，省时间有钱建议买配好的，严格执行说明书。
【在 l*****7 的大作中提到】
: 这么简单的问题需要问吗？
: 查查文献就能找出来原始或改良配方。
: N decades 前都是自己配自用， 根本不需要买。
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l*****7
发帖数: 8463 | 20 交叉污染几乎难免， 只是程度问题。
公司卖的和自配的没什么差别。
对那些对交叉污染要求不高的实验，很容易。
对那些对交叉污染要求很高的实验， 为将交叉污染减到尽可能小，必需修改protocol。
【在 S**********e 的大作中提到】
: 这个实验要做好确实需要高超的技巧，比方说，np40浓度，温度，时间，甚至细胞浓度
: 确实需要严格控制。否则最后结果可能多多少少有交叉污染，即使公司卖的也不是每一
: 个都有很少的细胞核细胞浆交叉污染，省时间有钱建议买配好的，严格执行说明书。
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