n**8
发帖数: 221 | 1 请问大侠，想裂解cultured cell，然后western blot detect一个核内的蛋白.
用的是RIPA buffer：
150 mM NaCl
1% NP40
0.5% of Sodium Deoxycholate
0.1% sodium dodecylsulfate (SDS)
50 mM Tris
请问这个buffer能破核膜么？（这个蛋白本身的丰度不高）
需不需要超声？
不甚感激！ |
a******c
发帖数: 597 | |
s******s
发帖数: 13035 | 3 做WB，又不是CoIP，这么扭捏干什么？统统2%SDS！
【在 n**8 的大作中提到】
: 请问大侠，想裂解cultured cell，然后western blot detect一个核内的蛋白.
: 用的是RIPA buffer：
: 150 mM NaCl
: 1% NP40
: 0.5% of Sodium Deoxycholate
: 0.1% sodium dodecylsulfate (SDS)
: 50 mM Tris
: 请问这个buffer能破核膜么？（这个蛋白本身的丰度不高）
: 需不需要超声？
: 不甚感激！
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n**8
发帖数: 221 | 4 多谢回复，
2%SDS 拿到的是lysate 不太好load啊。。 |
c********b
发帖数: 363 | 5 你的loading dye dilute 之后就是2% SDS啊，loading 没关系的，5%的我都用过，
dilute到2%也能跑。
一般如果是DNA binding蛋白最好上2%SDS, 不然就RIPA+Benzonase (多麻烦啊）。
【在 n**8 的大作中提到】
: 多谢回复，
: 2%SDS 拿到的是lysate 不太好load啊。。
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f******9
发帖数: 39 | 6 用2%SDS之后，要不要超声打断DNA的？
好像不超声，有很多Genomic DNA出来，样品会很粘的，有没有什么好办法？ |
n**8
发帖数: 221 | 7 同意ffff6699。
我也曾很粗放的2%SDS，结果lysate就跟粘胶一样，不好load |
c********b
发帖数: 363 | 8 我做的植物细胞，100度煮十分钟，然后14000 rpm 3分钟，还好，没什么DNA，不知道
animal cell会怎样。
【在 n**8 的大作中提到】
: 同意ffff6699。
: 我也曾很粗放的2%SDS，结果lysate就跟粘胶一样，不好load
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r*******y
发帖数: 48 | 9 no problem. Sonication is not needed if most of that protein are not bound
to chromatin. Spin 15 min at 14000 rpm, take the supernatant.
【在 n**8 的大作中提到】
: 请问大侠，想裂解cultured cell，然后western blot detect一个核内的蛋白.
: 用的是RIPA buffer：
: 150 mM NaCl
: 1% NP40
: 0.5% of Sodium Deoxycholate
: 0.1% sodium dodecylsulfate (SDS)
: 50 mM Tris
: 请问这个buffer能破核膜么？（这个蛋白本身的丰度不高）
: 需不需要超声？
: 不甚感激！
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s********r
发帖数: 312 | 10 我是biorad的那个loading buffer,950ul+50ul beta-ME,然后用水1:1稀释。直接加到
孔里，一般12孔板一个孔100-250ul，晃一晃等2分钟，然后200ul的tip前面剪掉，刮一
刮收起来，煮沸上样。 |
