D**A
发帖数: 311 | 1 最近把一个未知蛋白送去做mass spec sequencing. 结果让人不能理解，看有没有mass
spec达人能帮忙分析下。
蛋白是从细胞里提的，跑10% sds-page, coomassie blue stain，根据biorad的marker
来看，大小应该是45-48kd之间。
切下胶去做mass spec （nano-LC, MS/MS, ESI），结果显示为一个33kd的蛋白 （79个
peptide， 53%coverage）。当然还参杂了其他蛋白，但是peptide数量不多。
从33kd到45kd, 差了30%多。。。我们在想，有没有可能mass spec的人搞砸了。
希望有人可以帮忙分析下，先谢了。 |
s******y
发帖数: 28562 | 2 Mass Spec 对于分子量几乎没有搞错的可能性，除非你们正好送去了一个被
proteolytic cleaved 的片断。倒是SDS_PAGE其实是很不准确的，因为跑出来的结果和
蛋白的形状和修饰状态都有关。
mass
marker
【在 D**A 的大作中提到】
: 最近把一个未知蛋白送去做mass spec sequencing. 结果让人不能理解，看有没有mass
: spec达人能帮忙分析下。
: 蛋白是从细胞里提的，跑10% sds-page, coomassie blue stain，根据biorad的marker
: 来看，大小应该是45-48kd之间。
: 切下胶去做mass spec （nano-LC, MS/MS, ESI），结果显示为一个33kd的蛋白 （79个
: peptide， 53%coverage）。当然还参杂了其他蛋白，但是peptide数量不多。
: 从33kd到45kd, 差了30%多。。。我们在想，有没有可能mass spec的人搞砸了。
: 希望有人可以帮忙分析下，先谢了。
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m******o
发帖数: 8504 | 3 搞下这个33KD的抗体，WB一下看看是不是大小再45左右 |
D**A
发帖数: 311 | 4 这个是未知蛋白，即便自己做抗体，又如何能保证没有non specific band.
【在 m******o 的大作中提到】
: 搞下这个33KD的抗体，WB一下看看是不是大小再45左右
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D**A
发帖数: 311 | 5 和另外一个facility 的mass spec的人谈了，他们也觉得不会有什么问题。
虽然mass spec的质量不高，但是因为有17个unique peptide，他们觉得没什么问题
【在 s******y 的大作中提到】
: Mass Spec 对于分子量几乎没有搞错的可能性，除非你们正好送去了一个被
: proteolytic cleaved 的片断。倒是SDS_PAGE其实是很不准确的，因为跑出来的结果和
: 蛋白的形状和修饰状态都有关。
:
: mass
: marker
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j****n
发帖数: 3370 | 6 糖基化？
mass
marker
【在 D**A 的大作中提到】
: 最近把一个未知蛋白送去做mass spec sequencing. 结果让人不能理解，看有没有mass
: spec达人能帮忙分析下。
: 蛋白是从细胞里提的，跑10% sds-page, coomassie blue stain，根据biorad的marker
: 来看，大小应该是45-48kd之间。
: 切下胶去做mass spec （nano-LC, MS/MS, ESI），结果显示为一个33kd的蛋白 （79个
: peptide， 53%coverage）。当然还参杂了其他蛋白，但是peptide数量不多。
: 从33kd到45kd, 差了30%多。。。我们在想，有没有可能mass spec的人搞砸了。
: 希望有人可以帮忙分析下，先谢了。
|
l***y
发帖数: 638 | 7 跑胶大小不准的，好多修饰会影响，能看到其他杂蛋白都是啥吗，这个33kd的应该是打
出来最多的吧
mass
marker
【在 D**A 的大作中提到】
: 最近把一个未知蛋白送去做mass spec sequencing. 结果让人不能理解，看有没有mass
: spec达人能帮忙分析下。
: 蛋白是从细胞里提的，跑10% sds-page, coomassie blue stain，根据biorad的marker
: 来看，大小应该是45-48kd之间。
: 切下胶去做mass spec （nano-LC, MS/MS, ESI），结果显示为一个33kd的蛋白 （79个
: peptide， 53%coverage）。当然还参杂了其他蛋白，但是peptide数量不多。
: 从33kd到45kd, 差了30%多。。。我们在想，有没有可能mass spec的人搞砸了。
: 希望有人可以帮忙分析下，先谢了。
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f*******K
发帖数: 34 | 8 从质谱角度来说，有一种可能性，你的蛋白质有没有其他的小分子量的isoform？如果
你的蛋白质不在数据库里面，而是其小分子量的isoform在数据库里面，搜库结果就有
可能只鉴定到小的isoform. |
f*******K
发帖数: 34 | 9 你可以看看下面得分稍微低一点的蛋白质有没有其isoform的。
这两天在美国开ASMS,感觉美国质谱领域华人真多啊!! |
D**A
发帖数: 311 | 10 没有看到有其他isoform的。
最让我不能理解还有一个，是他们做了一个instrument performance results, 用的
BSA, 测到19个peptide，33%coverage, 这个太低了吧？
【在 f*******K 的大作中提到】
: 你可以看看下面得分稍微低一点的蛋白质有没有其isoform的。
: 这两天在美国开ASMS,感觉美国质谱领域华人真多啊!!
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f*******K
发帖数: 34 | 11 是有点低，但这个取决于它上样量的多少等很多其他因素，不好评价。
你的coverage有55%，我觉得问题不大。
你要是有精力，自己找几个unannotated spectra做de novo sequencing 看看有没有什
么特异性的peptide由于数据库等原因没有坚定到的
简单来说，找另外一不同MS在鉴定一下呗 |
D**A
发帖数: 311 | 12 没有看到有其他isoform的。
最让我不能理解还有一个，是他们做了一个instrument performance results, 用的
BSA, 测到19个peptide，33%coverage, 这个太低了吧？
【在 f*******K 的大作中提到】
: 你可以看看下面得分稍微低一点的蛋白质有没有其isoform的。
: 这两天在美国开ASMS,感觉美国质谱领域华人真多啊!!
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D***a
发帖数: 516 | 13 克隆这个基因，加个tag再看western条带在哪里。或者用重组蛋白跑。分子量和wb条带
位置差个10几kd很正常。
【在 D**A 的大作中提到】
: 这个是未知蛋白，即便自己做抗体，又如何能保证没有non specific band.
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i******g
发帖数: 90 | 14 55% coverage 问题不大， 因为你不能确定有哪种蛋白修饰， 另外还有样品准备方法
， 上样量等。 不过15% coverage on bsa 是比较低呀， 怎么也得80%以上吧。我感觉
是样品没做好， 叫facility重新制样 ， 在跑一下质谱吧。 |
D**A
发帖数: 311 | 15 这个要等我们把蛋白序列测出来才能做。
【在 D***a 的大作中提到】
: 克隆这个基因，加个tag再看western条带在哪里。或者用重组蛋白跑。分子量和wb条带
: 位置差个10几kd很正常。
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D***a
发帖数: 516 | 16 你不已经知道是什么基因了吗？
【在 D**A 的大作中提到】
: 这个要等我们把蛋白序列测出来才能做。
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S*******l
发帖数: 4637 | 17 可能是 ubiquitinated/sumoylated蛋白？加上一个就差不多40多KD了。
mass
marker
【在 D**A 的大作中提到】
: 最近把一个未知蛋白送去做mass spec sequencing. 结果让人不能理解，看有没有mass
: spec达人能帮忙分析下。
: 蛋白是从细胞里提的，跑10% sds-page, coomassie blue stain，根据biorad的marker
: 来看，大小应该是45-48kd之间。
: 切下胶去做mass spec （nano-LC, MS/MS, ESI），结果显示为一个33kd的蛋白 （79个
: peptide， 53%coverage）。当然还参杂了其他蛋白，但是peptide数量不多。
: 从33kd到45kd, 差了30%多。。。我们在想，有没有可能mass spec的人搞砸了。
: 希望有人可以帮忙分析下，先谢了。
|
y*****i
发帖数: 23 | 18 他们给你的蛋白只要不是keratin，基本是没错的，因为有79个肽段支持，除非蛋白库
给错了。
你可以看看基因组上，该蛋白是不是有其它isoform的可能。
否则很可能是修饰，如果是的话，找到这个修饰也是很interesting 的发现，你赚了。 |
D***a
发帖数: 516 | 19 这两个修饰，即使加了去修饰的inhibitor，也基本不可能在coomassie染色上看见，何
况不加。
【在 S*******l 的大作中提到】
: 可能是 ubiquitinated/sumoylated蛋白？加上一个就差不多40多KD了。
:
: mass
: marker
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y*****s
发帖数: 1047 | 20 This is not about the mass accuracy. MS only looks at the m/z of peptide
ions and fragment ions and match them with the theoretic values calculated
from known genome. If the observed and theoretic values match with each
other, then the peptide is identified. OP's question is really how can a
45kDa protein have a sequence of a 33kDa protein. |
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s******y
发帖数: 28562 | 21 也不一定，如果非要较真的话，有些蛋白，比方说组蛋白和某些核内蛋白，
是可以有稳定的mon ubiquitin 修饰的。
当然这种情况对于cytoplasmic protein 很罕见，所以我也就是来抬个杠 :)
【在 D***a 的大作中提到】
: 这两个修饰，即使加了去修饰的inhibitor，也基本不可能在coomassie染色上看见，何
: 况不加。
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s******y
发帖数: 28562 | 22 貌似楼主并不确实的知道那个蛋白是45kDa 的呀。他的信息是从SDS-PAGE上得来的，而
那个是一个非常不准确的方法。
不过你这倒是提醒了我另外一件事，那就是楼主应该把那个基因的mRNA克隆出来，看看
到底这个coding sequence 是有多长。
【在 y*****s 的大作中提到】
: This is not about the mass accuracy. MS only looks at the m/z of peptide
: ions and fragment ions and match them with the theoretic values calculated
: from known genome. If the observed and theoretic values match with each
: other, then the peptide is identified. OP's question is really how can a
: 45kDa protein have a sequence of a 33kDa protein.
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D**A
发帖数: 311 | 23 谢谢大家的建议。
我们决定还是换一个facility来测下，我觉得true positive肯定在list里面，但不一
定是冠军蛋白（33kda那个）。 |
f******r
发帖数: 96 | 24 Try LC-MSMS, you can get the peptide sequence and modification information. |
K******S
发帖数: 10109 | 25 看帖不仔细，呵呵。
【在 f******r 的大作中提到】
: Try LC-MSMS, you can get the peptide sequence and modification information.
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K******S
发帖数: 10109 | 26 在做一次之前让这个地方search一下modification. 反正raw data已经有了，就是重新
设定一下数据库检索的参数。另外他们用什么仪器? 我做qc只用几个femto mole的bsa,
5分钟的lc gradient,出来就是30%的coverage. 那种上巨多的量得出几乎100%的qc一点
用没有。
【在 D**A 的大作中提到】
: 谢谢大家的建议。
: 我们决定还是换一个facility来测下，我觉得true positive肯定在list里面，但不一
: 定是冠军蛋白（33kda那个）。
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D**A
发帖数: 311 | 27 他们用的是nano-lc LTQ linear iron trap，我搜了下，这个仪器挺老的。不知道仪器
新旧是否会有影响
样品已经送去了另外一个地方。
bsa,
【在 K******S 的大作中提到】
: 在做一次之前让这个地方search一下modification. 反正raw data已经有了，就是重新
: 设定一下数据库检索的参数。另外他们用什么仪器? 我做qc只用几个femto mole的bsa,
: 5分钟的lc gradient,出来就是30%的coverage. 那种上巨多的量得出几乎100%的qc一点
: 用没有。
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a*******e
发帖数: 245 | 28 mass spec 出错的可能性比较小
还有，通过sds－page来判断蛋白质大小的这种方法太不准确了，有些蛋白（没有任何
posttranslational修饰）在page胶甚至可以表现出2倍于理论分子量的size，所以你不
能说这个33kd的蛋白质就一定不是你的target protein。
当然size上的不一致也有可能是蛋白的修饰引起的，尤其是在细胞里提取的蛋白
mass
marker
【在 D**A 的大作中提到】
: 最近把一个未知蛋白送去做mass spec sequencing. 结果让人不能理解，看有没有mass
: spec达人能帮忙分析下。
: 蛋白是从细胞里提的，跑10% sds-page, coomassie blue stain，根据biorad的marker
: 来看，大小应该是45-48kd之间。
: 切下胶去做mass spec （nano-LC, MS/MS, ESI），结果显示为一个33kd的蛋白 （79个
: peptide， 53%coverage）。当然还参杂了其他蛋白，但是peptide数量不多。
: 从33kd到45kd, 差了30%多。。。我们在想，有没有可能mass spec的人搞砸了。
: 希望有人可以帮忙分析下，先谢了。
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D**A
发帖数: 311 | 29 后续，
把同样的sample送去了另外一个地方，据说有个很高级的mass spec，5600还是什么的
，而且还便宜。
1， 两个facility基本都发现同一批蛋白，高级的机器果然比旧机器好，发现更多的蛋
白，而且发现的peptide数目要多很多很多。
2， 旧机器发现的冠军蛋白A，在新机器下面不再是冠军蛋白。
3，新的冠军蛋白三周前search还是37kDa, 上周NCBI居然update成了47kDa, N
terminal多出一串amino acid，所以基本符合sds-page胶的预测 (45kda)。
最后，还是谢谢各位mass spec达人的解疑。 |
l****y
发帖数: 398 | 30 就你的描述，这条带到底是新冠军，老冠军，还是两种
[在 DDDA (QQQQA) 的大作中提到：]
:后续，
:把同样的sample送去了另外一个地方，据说有个很高级的mass spec，5600还是什么的
:，而且还便宜。
:1， 两个facility基本都发现同一批蛋白，高级的机器果然比旧机器好，发现更多的
蛋白，而且发现的peptide数目要多很多很多。
:terminal多出一串amino acid，所以基本符合sds-page胶的预测 (45kda)。
:最后，还是谢谢各位mass spec达人的解疑。 |
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l****y
发帖数: 398 | 31 就你的描述，还不能完全确定这条带到底是新冠军，老冠军，还是两种各一半。
怕你急着往下做出错。
[在 DDDA (QQQQA) 的大作中提到：]
:后续，
:把同样的sample送去了另外一个地方，据说有个很高级的mass spec，5600还是什么的
:，而且还便宜。
:1， 两个facility基本都发现同一批蛋白，高级的机器果然比旧机器好，发现更多的
蛋白，而且发现的peptide数目要多很多很多。
:terminal多出一串amino acid，所以基本符合sds-page胶的预测 (45kda)。
:最后，还是谢谢各位mass spec达人的解疑。 |
D**A
发帖数: 311 | 32 谢谢建议。
现在还不能确定，我已经把两个基因的CDNA买回来了，一起都试试。
【在 l****y 的大作中提到】
: 就你的描述，还不能完全确定这条带到底是新冠军，老冠军，还是两种各一半。
: 怕你急着往下做出错。
: [在 DDDA (QQQQA) 的大作中提到：]
: :后续，
: :把同样的sample送去了另外一个地方，据说有个很高级的mass spec，5600还是什么的
: :，而且还便宜。
: :1， 两个facility基本都发现同一批蛋白，高级的机器果然比旧机器好，发现更多的
: 蛋白，而且发现的peptide数目要多很多很多。
: :terminal多出一串amino acid，所以基本符合sds-page胶的预测 (45kda)。
: :最后，还是谢谢各位mass spec达人的解疑。
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s******y
发帖数: 28562 | 33 晕！ 我们都被你误导了，我们都以为你对质谱很熟悉，所以当你说蛋白质量的时候，
我们都以为你是用TOF 方法测的全蛋白的质量，所以告诉你说这个方法不会出错。但是
从你贴的更新看来，你对质谱不是很熟悉，你其实是用的普通的protein
identification protocol,质量数据其实是从数据库里抓的而不是直接测的，这个的确
是有可能出错的，因为对于一些新蛋白，数据库的数据并不一定准确。
但是要注意的是如果蛋白有isoform的话有可能两个都是正确的。所以你应该告诉那些
跑质谱的人你需要测全蛋白的质量，让他们换一个测量的protocol。
【在 D**A 的大作中提到】
: 后续，
: 把同样的sample送去了另外一个地方，据说有个很高级的mass spec，5600还是什么的
: ，而且还便宜。
: 1， 两个facility基本都发现同一批蛋白，高级的机器果然比旧机器好，发现更多的蛋
: 白，而且发现的peptide数目要多很多很多。
: 2， 旧机器发现的冠军蛋白A，在新机器下面不再是冠军蛋白。
: 3，新的冠军蛋白三周前search还是37kDa, 上周NCBI居然update成了47kDa, N
: terminal多出一串amino acid，所以基本符合sds-page胶的预测 (45kda)。
: 最后，还是谢谢各位mass spec达人的解疑。
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g*****x
发帖数: 3283 | 34 1. 首先你得明白MS测序的原理。33kd这个数字不是MS测出来的，是根据tandem ms的结
果从数据库里match出来的。
2. 所以你的问题在于蛋白的identification，不在MS的误差。
3. 你蛋白纯度怎么样？tandem ms方法没办法保证100%的coverage，如果你的target蛋
白只占10%以下，很难保证一定能做出来。
mass
marker
【在 D**A 的大作中提到】
: 最近把一个未知蛋白送去做mass spec sequencing. 结果让人不能理解，看有没有mass
: spec达人能帮忙分析下。
: 蛋白是从细胞里提的，跑10% sds-page, coomassie blue stain，根据biorad的marker
: 来看，大小应该是45-48kd之间。
: 切下胶去做mass spec （nano-LC, MS/MS, ESI），结果显示为一个33kd的蛋白 （79个
: peptide， 53%coverage）。当然还参杂了其他蛋白，但是peptide数量不多。
: 从33kd到45kd, 差了30%多。。。我们在想，有没有可能mass spec的人搞砸了。
: 希望有人可以帮忙分析下，先谢了。
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g*****x
发帖数: 3283 | 35 他这个33 kd明显不可能是MS测出来的，应该是mascot/sequest/spectrum mill等对
sequence数据库match以后给的数字。
【在 s******y 的大作中提到】
: Mass Spec 对于分子量几乎没有搞错的可能性，除非你们正好送去了一个被
: proteolytic cleaved 的片断。倒是SDS_PAGE其实是很不准确的，因为跑出来的结果和
: 蛋白的形状和修饰状态都有关。
:
: mass
: marker
|
g*****x
发帖数: 3283 | 36 这个。。。
现在orbitrap是标配。。。
【在 D**A 的大作中提到】
: 他们用的是nano-lc LTQ linear iron trap，我搜了下，这个仪器挺老的。不知道仪器
: 新旧是否会有影响
: 样品已经送去了另外一个地方。
:
: bsa,
|
g*****x
发帖数: 3283 | 37 他拿着gel band去做ms，一眼就看出这是database search结果啊。
【在 s******y 的大作中提到】
: 晕！ 我们都被你误导了，我们都以为你对质谱很熟悉，所以当你说蛋白质量的时候，
: 我们都以为你是用TOF 方法测的全蛋白的质量，所以告诉你说这个方法不会出错。但是
: 从你贴的更新看来，你对质谱不是很熟悉，你其实是用的普通的protein
: identification protocol,质量数据其实是从数据库里抓的而不是直接测的，这个的确
: 是有可能出错的，因为对于一些新蛋白，数据库的数据并不一定准确。
: 但是要注意的是如果蛋白有isoform的话有可能两个都是正确的。所以你应该告诉那些
: 跑质谱的人你需要测全蛋白的质量，让他们换一个测量的protocol。
|
g*****x
发帖数: 3283 | 38
说实话，5600是triple-q，这玩意做蛋白还是差了些。
【在 D**A 的大作中提到】
: 后续，
: 把同样的sample送去了另外一个地方，据说有个很高级的mass spec，5600还是什么的
: ，而且还便宜。
: 1， 两个facility基本都发现同一批蛋白，高级的机器果然比旧机器好，发现更多的蛋
: 白，而且发现的peptide数目要多很多很多。
: 2， 旧机器发现的冠军蛋白A，在新机器下面不再是冠军蛋白。
: 3，新的冠军蛋白三周前search还是37kDa, 上周NCBI居然update成了47kDa, N
: terminal多出一串amino acid，所以基本符合sds-page胶的预测 (45kda)。
: 最后，还是谢谢各位mass spec达人的解疑。
|
D**A
发帖数: 311 | 39 谢谢胖老师，真是热心。
我们对mass spec真的不熟, 拿到data老板也很疑惑。
【在 s******y 的大作中提到】
: 晕！ 我们都被你误导了，我们都以为你对质谱很熟悉，所以当你说蛋白质量的时候，
: 我们都以为你是用TOF 方法测的全蛋白的质量，所以告诉你说这个方法不会出错。但是
: 从你贴的更新看来，你对质谱不是很熟悉，你其实是用的普通的protein
: identification protocol,质量数据其实是从数据库里抓的而不是直接测的，这个的确
: 是有可能出错的，因为对于一些新蛋白，数据库的数据并不一定准确。
: 但是要注意的是如果蛋白有isoform的话有可能两个都是正确的。所以你应该告诉那些
: 跑质谱的人你需要测全蛋白的质量，让他们换一个测量的protocol。
|
D**A
发帖数: 311 | 40 不知道什么机器才够拿来做蛋白，貌似学校的机器都很老了。看来以后要换地方做mass
spec了。
【在 g*****x 的大作中提到】
:
: 说实话，5600是triple-q，这玩意做蛋白还是差了些。
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s******y
发帖数: 28562 | 41 哎，主要是我们过于想当然了。白白给了那么多无关的建议：）
【在 g*****x 的大作中提到】
: 他拿着gel band去做ms，一眼就看出这是database search结果啊。
|
g*****x
发帖数: 3283 | 42 如果你的样品简单，就几种蛋白，而且你的target是主要的，那LTQ/triple-Q估计也能
做出结果。这俩仪器主要还是用来做小分子的。
如果你样品复杂，纯度又很低，最好找个做proteomics的来做，现在基本都是orbitrap
了。
另外你最好懂这方面的人evaluate一下结果，尤其sample复杂的时候想要做出
conclusive的结论不容易。
mass
【在 D**A 的大作中提到】
: 不知道什么机器才够拿来做蛋白，貌似学校的机器都很老了。看来以后要换地方做mass
: spec了。
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K******S
发帖数: 10109 | 43 5600是TRIPLE QUAD 加 TOF
做个蛋白定性足够了
【在 g*****x 的大作中提到】
: 如果你的样品简单，就几种蛋白，而且你的target是主要的，那LTQ/triple-Q估计也能
: 做出结果。这俩仪器主要还是用来做小分子的。
: 如果你样品复杂，纯度又很低，最好找个做proteomics的来做，现在基本都是orbitrap
: 了。
: 另外你最好懂这方面的人evaluate一下结果，尤其sample复杂的时候想要做出
: conclusive的结论不容易。
:
: mass
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g*****x
发帖数: 3283 | 44 我说了，看纯度和样品复杂度
【在 K******S 的大作中提到】
: 5600是TRIPLE QUAD 加 TOF
: 做个蛋白定性足够了
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