f*******K
发帖数: 34 | 1 在博后期间，合成一种Cys特异性的phosphanate tag，用于Cys Proteome， Cys PTMs
，以及the cross-talk between Cys PTMs and phosphorylation研究应用。方法具有
高度的特异性，高效性，已经多家独立实验室验证。
关于方法意义，引用reviewer comment：
1. To my knowledgy, the CysPAT strategy is the first method to
simultaneously
measure cysteine proteome and protein phosphorylation from the same sample,
which is the major novelty of this study.
相关tag合成方法及应用方法，已经申请美国专利。
文章在MCP发表：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27281782
欢迎大家讨论使用。
Abstract:
Cysteine is a rare and conserved amino acid involved in most cellular
functions. The thiol group of cysteine can be subjected to diverse oxidative
modifications that regulate many physio-pathological states. In the present
work, a Cysteine-specific Phosphonate Adaptable Tag (CysPAT) was
synthesized to selectively label cysteine-containing peptides (Cys peptides)
followed by their enrichment with titanium dioxide (TiO2) and subsequent
mass spectrometric analysis. The CysPAT strategy was developed using a
synthetic peptide, a standard protein and subsequently the strategy was
applied to protein lysates from Hela cells, achieving high specificity and
enrichment efficiency. In particular, for Cys proteome analysis, the method
led to the identification of 7509 unique Cys peptides from 500ug of HeLa
cell lysate starting material. Furthermore, the method was developed to
simultaneously enrich Cys peptides and phosphorylated peptides. This
strategy was applied to SILAC labelled Hela cells subjected to 5 min
epidermal growth factor (EGF) stimulation. In total, 10440 unique reversibly
modified Cys peptides (3855 proteins) and 7339 unique phosphopeptides (2234
proteins) were simultaneously identified from 250 ug starting material.
Significant regulation was observed in both phosphorylation and reversible
Cys modification of proteins involved in EGFR signaling. Our data indicates
that EGF stimulation can activate the well-known phosphorylation of EGFR and
downstream signaling molecules, such as mitogen-activated protein kinases (
MAPK1 and MAPK3), however, it also leads to substantial modulation of
reversible cysteine modifications in numerous proteins. Several protein
tyrosine phosphatases (PTPs) showed a reduction of the catalytic Cys site in
the conserved putative phosphatase HC(X)5R motif indicating an activation
and subsequent de-phosphorylation of proteins involved in the EGF signaling
pathway. Overall, the CysPAT strategy is a straight forward, easy and
promising method for studying redox proteomics and the simultaneous
enrichment strategy offers an excellent solution for characterization of
cross-talk between phosphorylation and redox induced reversible cysteine
modifications. | f*******K
发帖数: 34 | | f*******K
发帖数: 34 | | d****i
发帖数: 2346 | | f*******K
发帖数: 34 | 5 简单解释如下：
做过磷酸化蛋白质组学的应该都知道，TiO2针对磷酸化基团具有很高的亲和性和特异性
，因此TiO2被广泛应用于富集磷酸化肽段的磷酸化蛋白质组研究，以分析磷酸化介导的
信号通路.TiO2富集磷酸化peptide的方法由我博后老板Martin R. Larsen 2005年发表
于MCP,引用有大约1500多次，相关专利被Thermo收购。
在本工作中，我们通过化学合成一种phosphanate tag,该tag可以特异性与Cys的free
thiol group反应，从而用于标记Cys peptide,由于tag含有phosphanate group, 从而
标记的Cys peptide可以用TiO2富集，原理类似于富集磷酸化peptide。更进一步，我们
的方法可以从同一样品同时富集cys peptides和Phosphopeptides, 从而可用于研究两
种PTM的相互作用the cross-talk between Cys PTMs and phosphorylation。 | s*********n
发帖数: 128 | 6 http://link.springer.com/article/10.1007/s13361-014-1059-9
Herein, we developed two novel cysteine-based quantitative proteomics
workflows. The first method is cysteine-selective precursor dimethyl
labeling (cysDML). In this workflow, cysteinyl-peptides are captured on a
commercially available Thiopropyl Sepharose 6B resin and captured peptides
are labeled on resin with either light (–C2H6) or heavy (–13C2 2H6)
dimethyl tags [43]. CysDML appears to be a convenient, efficient, accurate,
and affordable cysteine-selective quantitative proteomic technique. However,
this approach is limited to a maximum of two samples in this report; thus,
we sought to develop another approach that could significantly improve on
sample multiplexing capabilities.
楼主的方法应该work，最好能方便别人买试剂 | g*****x
发帖数: 3283 | 7 我没有冒犯的意思，但我不太理解这个方法和传统的用tag标记分离cys和TiO2富集
phosphorylated蛋白有什么好处？什么样的应用需要同时分离cys和磷酸化蛋白？
而且这个tag在结构上貌似也没有什么特别之处，和其他同时含有iodoacetamide+
phosphate的tag比有什么特殊之处？还有为什么要用phosphonate而不是直接用
phosphate？
PTMs
【在 f*******K 的大作中提到】
: 在博后期间，合成一种Cys特异性的phosphanate tag，用于Cys Proteome， Cys PTMs
: ，以及the cross-talk between Cys PTMs and phosphorylation研究应用。方法具有
: 高度的特异性，高效性，已经多家独立实验室验证。
: 关于方法意义，引用reviewer comment：
: 1. To my knowledgy, the CysPAT strategy is the first method to
: simultaneously
: measure cysteine proteome and protein phosphorylation from the same sample,
: which is the major novelty of this study.
: 相关tag合成方法及应用方法，已经申请美国专利。
: 文章在MCP发表：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27281782
| s*********y
发帖数: 292 | 8 请问富集cys peptide有什么用处呢？为什么cys和磷酸化是相互作用的？
【在 f*******K 的大作中提到】
: 简单解释如下：
: 做过磷酸化蛋白质组学的应该都知道，TiO2针对磷酸化基团具有很高的亲和性和特异性
: ，因此TiO2被广泛应用于富集磷酸化肽段的磷酸化蛋白质组研究，以分析磷酸化介导的
: 信号通路.TiO2富集磷酸化peptide的方法由我博后老板Martin R. Larsen 2005年发表
: 于MCP,引用有大约1500多次，相关专利被Thermo收购。
: 在本工作中，我们通过化学合成一种phosphanate tag,该tag可以特异性与Cys的free
: thiol group反应，从而用于标记Cys peptide,由于tag含有phosphanate group, 从而
: 标记的Cys peptide可以用TiO2富集，原理类似于富集磷酸化peptide。更进一步，我们
: 的方法可以从同一样品同时富集cys peptides和Phosphopeptides, 从而可用于研究两
: 种PTM的相互作用the cross-talk between Cys PTMs and phosphorylation。
| f*******K
发帖数: 34 | 9 我知道这篇文章，Sample Multiplexing with Cysteine-Selective Approaches:
cysDML and cPILOT, 相关工作在ASMS会议报道过。他们所用的方法基本还是基于传统
方法改良如Thiopropyl Sepharose 6B resin和Cys TMT，这些基于抗体和resin方法的
富集效率比较低，从鉴定数目就可以看到。我们的富集效率可以达到97%，很轻松鉴定
到10000+ unique peptides。
目前没有同时含有iodoacetamide+phosphate的tag。phosphate可能会被phosphatase酶
切掉，phosphonate不能，因此更加稳定。
至于为什么要富集Cys peptide,因为其low abundance,essential for the biological
activity and structure, highly sensitive and reactive.
同时富集目的是研究PTM crosstalk.在我的文章里面有很好的例子，protein tyrosine
phosphatases(PTPs) is important for regulation of tyrosine phosphorylation,
however, the activity of PTPs is determined by the Cys oxidation status, | d****i
发帖数: 2346 | 10 请教楼主：
我有一个蛋白酶可能是受Cys oxidation调节酶活性，能利用你的办法把我的蛋白
enrich然后检测氧化还原状态吗？
我这个蛋白已有文章发表说有磷酸化调节，但是我还没有把磷酸化和氧化还原联系在一
起。希望在你这里能得到一些启发。
谢谢！ | | | a**y
发帖数: 171 | 11 LZ的方法有用， 但买不到你的试剂也没法用啊。 | g*****x
发帖数: 3283 | 12 这试剂自己一天能合成一斤。
【在 a**y 的大作中提到】
: LZ的方法有用， 但买不到你的试剂也没法用啊。
| w*******i
发帖数: 11 | 13 Cys的丰度还是低，如果和磷酸化在一起，磷酸化肽段会抑制cys的检出吗, shotgun的
话？抱歉没看原文，这个方法鉴定到的cys和以前的方法的有比较吗？
biological
tyrosine
【在 f*******K 的大作中提到】
: 我知道这篇文章，Sample Multiplexing with Cysteine-Selective Approaches:
: cysDML and cPILOT, 相关工作在ASMS会议报道过。他们所用的方法基本还是基于传统
: 方法改良如Thiopropyl Sepharose 6B resin和Cys TMT，这些基于抗体和resin方法的
: 富集效率比较低，从鉴定数目就可以看到。我们的富集效率可以达到97%，很轻松鉴定
: 到10000+ unique peptides。
: 目前没有同时含有iodoacetamide+phosphate的tag。phosphate可能会被phosphatase酶
: 切掉，phosphonate不能，因此更加稳定。
: 至于为什么要富集Cys peptide,因为其low abundance,essential for the biological
: activity and structure, highly sensitive and reactive.
: 同时富集目的是研究PTM crosstalk.在我的文章里面有很好的例子，protein tyrosine
| f*******K
发帖数: 34 | 14 Phosphopeptides是亲水性的，tag标记后的Cys peptides是相对疏水性的，可以通过
HILIC相对区分开，降低他们的相互影响。和以前的方法相比，鉴定数目明显胜出。
To dahuzi,我不知道你这个蛋白的相对丰度，不好给具体建议。不过如果你的蛋白质
里面那些包含你感兴趣的PTMs sites的peptides能够通过常规LCMSMS鉴定到,那么我的
方法应该也能。不过对单个蛋白质，你可以考虑做topdown,应该更直接。 | f*******K
发帖数: 34 | 15 自己顶一下，开始找工作了，对该技术感兴趣的可以联系我, 带人带技术。
另，满屏都是韩春雨，搞不懂，其实和很多人都没有关系的，真金不怕火炼，就让子弹
再飞一段时间何妨 | f*******K
发帖数: 34 | 16 最近一家领域内知名公司联系我们，打算购买专利产品商业化 | l*****7
发帖数: 8463 | 17 你的技术主要用于研究细胞内代谢和信息传导中蛋白的功能状态【磷酸化或去磷酸化
（激活或失活）和酶】
如果效率高，特异性强，应该很实用。 |
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