c********6
发帖数: 693 | 1 借着韩春雨的光，生物版这么火。想再来跟大家探讨一下一个用流式细胞仪双荧光筛选
系统来鉴定并筛选出那种两个allele都被成功编辑的干细胞。
具体思路：
1。CRISPR-Cas9和gRNA在靶标上引入双链断裂。
2。donor模版，模版上带有两段1000bp的同源臂和突变碱基，同源臂之间带有荧光标签
（GFP，BFP，或者RFP等等），同源臂之外donor的backbone上面带有与同源臂之间不同
的荧光标签。
3。每次电转的时候转入细胞：Cas9质粒，gRNA质粒，带有GFP的donor，带有RFP的
donor（两个donor的backbone上面都带有BFP用以排除random integration）。
4。电转过后几天等细胞长到足够数量筛选细胞，GFP+/RFP+/BFP-的细胞应该就是那种
两个allele都被成功编辑的。
5。很多人担心这个荧光标签无法移出，实际上可以使用Loxp系统，筛选出来的细胞直
接过表达CRE可以把荧光标签切除，虽然会有34bp的loxp位点遗留下来，但是你可以把
这个遗留位点选在intron不影响mRNA。或者可以使用piggyBac系统做到无缝移出。
不知道有没有人对这个有兴趣 |
c********6
发帖数: 693 | |
m****a
发帖数: 270 | 3 你的GFP/RFP放在Donor什么位置？如果要表达就得在exon里，这样岂不是和你loxp 位
点放intron 相矛盾 |
c********6
发帖数: 693 | 4 GFP/RFP在两个同源臂的中间，自带promoter，不需要在exon上，为了移除荧光标签，
标签的两边连LOXP或者PiggyBac的TTAA-ITR。
左同源臂-ttaa-ITR-promoter-GFP-polyA-ITR-ttaa-右同源臂-promoter-BFP-polyA-
donor backbone
通过同源重组之后，左同源臂-ttaa-ITR-promoter-GFP-polyA-ITR-ttaa-右同源臂 会
进入基因组，如果donor存在randon integration，那么BFP也会表达，筛选BFP
negative/GFP positive/RFP positive的细胞即可。
然后过表达piggyBac transposase之后，筛选标签移除，变成左同源臂-ttaa-右同
源臂，
突变成功。
在设计左同源臂和右同源臂的时候，选择带有ttaa的位点分界，ttaa不要包括在同源臂
内。
说到这里，你是不是应该去补习一下基础理论知识。
【在 m****a 的大作中提到】
: 你的GFP/RFP放在Donor什么位置？如果要表达就得在exon里，这样岂不是和你loxp 位
: 点放intron 相矛盾
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c********6
发帖数: 693 | 5 人的干细胞基因编辑，尤其是Cas9-D10A和Cpf1的效率远远没有张峰文章里公布的效率
那么高，很多实验室都无法重复Cas9-D10A的结果，有的实验室做出来的，你无法知道
人家是不是用的野生型的Cas9的data，dont trust these guys too much。有人想
要在人的干细胞中做Cas9的编辑，强烈建议使用筛选系统，尤其是是对于时间不充裕的
博士生。 |
f*******e
发帖数: 354 | 6 有个问题，你这个仅限于在人干细胞表达的基因，如果没有表达那就没有reporter可以
用了。 |
m****a
发帖数: 270 | 7 你这相当于要KI两个不同长片断来筛选biallelic mutation
感觉技术上可行，不是这方面的专家，我就说一点我个人的一点点看法
1. 编辑的效率比利用ssDNA oligo 作为Donor 低不少。
2. 两个位点同时KI GFP或者RFP这两种情况被排除掉了也进一步降低了效率
3. 要克隆和转染的质粒有点儿多，实验上操作有点复杂。 |
j*********g
发帖数: 463 | 8 挺好的，可以发一篇方法学的文章。
你几个月前就提出了吧，克隆做好了吗？ |
c********6
发帖数: 693 | 9 自带promoter，荧光的表达独立的，跟基因表不表达无关
【在 f*******e 的大作中提到】
: 有个问题，你这个仅限于在人干细胞表达的基因，如果没有表达那就没有reporter可以
: 用了。
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c********6
发帖数: 693 | 10
--你肯定没有做过ssODN用于hES的编辑，做过的话，你应该知道效率有多低，不要太
trust张峰的paper，是可行，但是效率低得吓人。没有足够时间和人力，建议上筛选。
--不太care这种情况，我是收集编辑成功的细胞，效率再低，只要我流式筛选到符合要
求的细胞，就成功。不会像ssODN那样需要很愚蠢的分单细胞去挨个手工筛选，想象一
下让你筛选2000个单克隆的genotyping是哪种工作量，很多实验室筛选到2000个单克隆
还没有正确编辑的细胞。
--相比筛选2000个单克隆，你觉得哪个复杂？ 克隆质粒一个星期就可以搞定。
【在 m****a 的大作中提到】
: 你这相当于要KI两个不同长片断来筛选biallelic mutation
: 感觉技术上可行，不是这方面的专家，我就说一点我个人的一点点看法
: 1. 编辑的效率比利用ssDNA oligo 作为Donor 低不少。
: 2. 两个位点同时KI GFP或者RFP这两种情况被排除掉了也进一步降低了效率
: 3. 要克隆和转染的质粒有点儿多，实验上操作有点复杂。
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c********6
发帖数: 693 | 11 我不打算发方法学了，就发一篇用这个方法得到的细胞系用于疾病模型的体外modeling
的文章。重点不强调该方法，而是focus到crispr在疾病模拟上的应用。
跟大家分享一下。
【在 j*********g 的大作中提到】
: 挺好的，可以发一篇方法学的文章。
: 你几个月前就提出了吧，克隆做好了吗？
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m****a
发帖数: 270 | 12
确实没做过hES，2000个克隆也太夸张了。。。。
【在 c********6 的大作中提到】
: 我不打算发方法学了，就发一篇用这个方法得到的细胞系用于疾病模型的体外modeling
: 的文章。重点不强调该方法，而是focus到crispr在疾病模拟上的应用。
: 跟大家分享一下。
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m*********D
发帖数: 1727 | 13 如果不在乎那个lox的34bp，不如就直接用一个g418筛选。我个人做的，两copy取代的
效率和一个copy取代的效率相差一倍。
如果想突变的基因是essential，可以考虑用两个guide，这样删掉一节，基因就失去了
功能。我就是这么干的。
我就是两个guide，两个筛选（purimycin筛transfected细胞，另一个marker筛突变子
），随便就拿了一百多个clone。1/4没突变，1/4双突变，1/2 单突变加另一个copy只
切没HDR。唯一的遗憾是没有一个克隆两个copy，一个突变一个wt。
【在 c********6 的大作中提到】
: GFP/RFP在两个同源臂的中间，自带promoter，不需要在exon上，为了移除荧光标签，
: 标签的两边连LOXP或者PiggyBac的TTAA-ITR。
: 左同源臂-ttaa-ITR-promoter-GFP-polyA-ITR-ttaa-右同源臂-promoter-BFP-polyA-
: donor backbone
: 通过同源重组之后，左同源臂-ttaa-ITR-promoter-GFP-polyA-ITR-ttaa-右同源臂 会
: 进入基因组，如果donor存在randon integration，那么BFP也会表达，筛选BFP
: negative/GFP positive/RFP positive的细胞即可。
: 然后过表达piggyBac transposase之后，筛选标签移除，变成左同源臂-ttaa-右同
: 源臂，
: 突变成功。
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c********6
发帖数: 693 | 14 如果你必须要两个拷贝都突变的话，也没得选择。你说的是knock-out吧，这个效率一
般很高。我是指的点突变，如果没有筛选系统，这个最后两个拷贝都被点突变成功的概
率是相当低的。
【在 m*********D 的大作中提到】
: 如果不在乎那个lox的34bp，不如就直接用一个g418筛选。我个人做的，两copy取代的
: 效率和一个copy取代的效率相差一倍。
: 如果想突变的基因是essential，可以考虑用两个guide，这样删掉一节，基因就失去了
: 功能。我就是这么干的。
: 我就是两个guide，两个筛选（purimycin筛transfected细胞，另一个marker筛突变子
: ），随便就拿了一百多个clone。1/4没突变，1/4双突变，1/2 单突变加另一个copy只
: 切没HDR。唯一的遗憾是没有一个克隆两个copy，一个突变一个wt。
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m*********D
发帖数: 1727 | 15 用G418筛选呀。没必要用两个marker来表明两个copy都点突变了。我说的是，就一个也
行。点突变的概率，两个copy都出现的概率比一个出现的概率少一半。
【在 c********6 的大作中提到】
: 如果你必须要两个拷贝都突变的话，也没得选择。你说的是knock-out吧，这个效率一
: 般很高。我是指的点突变，如果没有筛选系统，这个最后两个拷贝都被点突变成功的概
: 率是相当低的。
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c********6
发帖数: 693 | 16 在我们的细胞系里边，两个拷贝都被突变的概率几乎为零啊，如果不用两个筛选标签，
非常难得到双突变的细胞。
【在 m*********D 的大作中提到】
: 用G418筛选呀。没必要用两个marker来表明两个copy都点突变了。我说的是，就一个也
: 行。点突变的概率，两个copy都出现的概率比一个出现的概率少一半。
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B*******y
发帖数: 17 | 17 思路挺好的，我也非常同意通过挑无数克隆再去做genotyping的工作量是非常恐怖的。
我不知道你是在思考这个strategy还是已经付出实践。如果你做的是human ESC，根据
我们实验室以及我一些朋友的经验，通过FACS把单细胞sort到96孔板里，即使全程都加
了ROCKi，存活效率非常之低，低得令人发指，和mouse ESC完全不是一个数量级的。我
的经验是大概一个96孔板能活5个左右，但是还不能确定karyotypes是不是正确的，以
及可能的假阳性。我更倾向于推荐使用drug resistent markers，比如一个puro，一个
neo。虽然neo的假阳性偏高些，但是single cell colony的survival要好非常多。同时
可以像你原本design那样加一个negative selection marker，比如GFP。
还有一个可能对你有用的hint是：可以设计两个gRNA去切除一段genomic DNA，然后只
用一个引入point mutation的donor （带puro）去做homologous recombination。可以
现在293细胞里筛选效率特别高（接近100%）的gRNA pair，这样也许能提高效率、减少
工作量。
我只用CRISPR/Cas9做过indel mutation，没有做过HDR。希望我的这些经验对你能有帮
助。同时，如果我思考错了，希望能帮我纠正。
【在 c********6 的大作中提到】
: 在我们的细胞系里边，两个拷贝都被突变的概率几乎为零啊，如果不用两个筛选标签，
: 非常难得到双突变的细胞。
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m****a
发帖数: 270 | 18 查了一下，
传统的mES细胞做 gene targeting 时做基本上都是靠药物做 positive-negative
selection，比如 NeoR-HSV-tk，
倒是有一篇文章用了类似你的思路，基于荧光做 positive-negative selection，
他们用的是 GFP-CFP，最后没把selction marker 去掉。
http://www.pnas.org/content/102/45/16357.full |
c********6
发帖数: 693 | 19 感谢你的宝贵意见，假阳性的问题也确实非常严重，我也构建了带不同药物筛选的系统
，但是两种药同时加的话，我基本上得不到存活的细胞。
【在 B*******y 的大作中提到】
: 思路挺好的，我也非常同意通过挑无数克隆再去做genotyping的工作量是非常恐怖的。
: 我不知道你是在思考这个strategy还是已经付出实践。如果你做的是human ESC，根据
: 我们实验室以及我一些朋友的经验，通过FACS把单细胞sort到96孔板里，即使全程都加
: 了ROCKi，存活效率非常之低，低得令人发指，和mouse ESC完全不是一个数量级的。我
: 的经验是大概一个96孔板能活5个左右，但是还不能确定karyotypes是不是正确的，以
: 及可能的假阳性。我更倾向于推荐使用drug resistent markers，比如一个puro，一个
: neo。虽然neo的假阳性偏高些，但是single cell colony的survival要好非常多。同时
: 可以像你原本design那样加一个negative selection marker，比如GFP。
: 还有一个可能对你有用的hint是：可以设计两个gRNA去切除一段genomic DNA，然后只
: 用一个引入point mutation的donor （带puro）去做homologous recombination。可以
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f*****n
发帖数: 499 | 20 1. 存活效率非常之低，低得令人发指
Try "conditioned" medium, which contains growth factor and cytokines blabla.
..
This trick works pretty much well for my neuroblastoma single cell
2.drug resistent markers，比如一个puro
I have horrible experience using puromycin, that you first establish "
survival curve" to figure out the optimal puro concentration to select those
puro-resistant,
but it seems everytime cell growth condition is slightly different, so the "
optimal" condition won't work at all.
3.Question: what's the efficiency of knock-in (HDR) efficiency? Maybe quite
cell type-specific?
【在 B*******y 的大作中提到】
: 思路挺好的，我也非常同意通过挑无数克隆再去做genotyping的工作量是非常恐怖的。
: 我不知道你是在思考这个strategy还是已经付出实践。如果你做的是human ESC，根据
: 我们实验室以及我一些朋友的经验，通过FACS把单细胞sort到96孔板里，即使全程都加
: 了ROCKi，存活效率非常之低，低得令人发指，和mouse ESC完全不是一个数量级的。我
: 的经验是大概一个96孔板能活5个左右，但是还不能确定karyotypes是不是正确的，以
: 及可能的假阳性。我更倾向于推荐使用drug resistent markers，比如一个puro，一个
: neo。虽然neo的假阳性偏高些，但是single cell colony的survival要好非常多。同时
: 可以像你原本design那样加一个negative selection marker，比如GFP。
: 还有一个可能对你有用的hint是：可以设计两个gRNA去切除一段genomic DNA，然后只
: 用一个引入point mutation的donor （带puro）去做homologous recombination。可以
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z*t
发帖数: 863 | 21 你这个类似的idea我也想过，后来没有exactly试过。说几句吧。
楼上有人提到的In vivo ligation我也试过，但是我的经验吧在HDR高的系统里（比如
老鼠胚胎）就是ssDON介导的HDR也非常有效。在我的细胞里（血液细胞）无论怎么搞
HDR就是看不见...
HDR提高效率公司里的人说最好用targeting vector。另外一点不利于这个idea（做模
型）的是现在dCas9-AID potential的效率和建议程度比HDR要高
【在 c********6 的大作中提到】
: 借着韩春雨的光，生物版这么火。想再来跟大家探讨一下一个用流式细胞仪双荧光筛选
: 系统来鉴定并筛选出那种两个allele都被成功编辑的干细胞。
: 具体思路：
: 1。CRISPR-Cas9和gRNA在靶标上引入双链断裂。
: 2。donor模版，模版上带有两段1000bp的同源臂和突变碱基，同源臂之间带有荧光标签
: （GFP，BFP，或者RFP等等），同源臂之外donor的backbone上面带有与同源臂之间不同
: 的荧光标签。
: 3。每次电转的时候转入细胞：Cas9质粒，gRNA质粒，带有GFP的donor，带有RFP的
: donor（两个donor的backbone上面都带有BFP用以排除random integration）。
: 4。电转过后几天等细胞长到足够数量筛选细胞，GFP+/RFP+/BFP-的细胞应该就是那种
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b****s
发帖数: 22 | 22 别的原代细胞系不好说，可能需要这样的方法，但是干细胞效率可以接受啊。具体看这
个paper
http://www.nature.com/nature/journal/v533/n7601/full/nature17664.html
我做ips的biallelic点突变最高有过10%的效率，最低也有3%。筛50个克隆肯定有。工
作量没有大到需要这样的方法。 |
c********6
发帖数: 693 | 23 干细胞也分很多类，比如hips，构建细胞系的方法不同有逆转录病毒和episomal 质粒
，等等。episomal得到的hiPS非常难editing。你是用的哪种iPS? Human 还是mouse？
【在 b****s 的大作中提到】
: 别的原代细胞系不好说，可能需要这样的方法，但是干细胞效率可以接受啊。具体看这
: 个paper
: http://www.nature.com/nature/journal/v533/n7601/full/nature17664.html
: 我做ips的biallelic点突变最高有过10%的效率，最低也有3%。筛50个克隆肯定有。工
: 作量没有大到需要这样的方法。
|
l***l
发帖数: 6 | 24 i used px458 for FACS in WA26hES 锛宨ndel is very high |
c********6
发帖数: 693 | 25 Indel在我们的细胞里面也是非常高的，几乎所有的筛选出来的细胞，两个拷贝都是被
切割了的，问题是经常只有一个拷贝通过同源重组把筛选标签和突变位点knock-in，另
一个拷贝却是NHEJ。
问题就是同源重组效率太低了，是不是因为我的同源臂之间的插入序列太长，我的有
5000多bp。
【在 l***l 的大作中提到】
: i used px458 for FACS in WA26hES 锛宨ndel is very high
|
l********e
发帖数: 415 | |
b****s
发帖数: 22 | 27
我用的是human的。
【在 c********6 的大作中提到】
: 干细胞也分很多类，比如hips，构建细胞系的方法不同有逆转录病毒和episomal 质粒
: ，等等。episomal得到的hiPS非常难editing。你是用的哪种iPS? Human 还是mouse？
|
c********6
发帖数: 693 | 28 human iPS如果是用lenti 或者retro virus制备的，还有sendai virus制备的 存活率
就高一些，比较容易editing。而用episomal 质粒制备的，则比较难editing，这种细
胞存活率很低。
【在 b****s 的大作中提到】
:
: 我用的是human的。
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