f*********r
发帖数: 1233 | 1 actin，我的理解是表达极强的蛋白。基本可以看作是housekeeping，做loading
control。所以应该是极强，至少也是很强。在默认设置下，应该是强信号，甚至是过
饱和。这种背景还算低，但actin信号几乎没有的情况，说明western本身有问题。
如果其他步骤没有出差错的话，最大问题就是二抗-milk组合出了问题。
odyssey是不推荐使用奶粉的。就是因为它太灵敏，牛奶甚至普通bsa的背景太高。
因为很多公司这么做，所以我怀疑licor也可能会这样。licor一向推荐自己出的二抗和
blocking buffer。尤其是后者，比牛奶和bsa都贵很多，是他们公司主打消耗品之一。
他们非常不愿意见到客户用廉价的奶粉。别家出的二抗他管不了，但是自家的二抗，很
可能有什么技术，保证它与奶粉和普通bsa不兼容。
下面有两个选项可以尝试一下。
1）改用licor专用blocking buffer试一下。
2）改用别家二抗试一下。（rockland, invitrogen等公司都有比较成熟的红外荧光二
抗）。
2个选项交叉试一下，一共4种条件（含原先二抗-奶粉组合）。有了这四种对... 阅读全帖 |
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s******r
发帖数: 2876 | 2 这个sample本身就比较稀，第一条lane已经是1:5稀释，后面是1:25, 1:125稀释。
所以western 本身的问题应该不大，主要是想看看在我手里ECL和Odyssey哪个好使，
可能二抗和blocking buffer都不够好，所以我这个看起来Odyssey比普通ECL要弱上
几倍。
actin，我的理解是表达极强的蛋白。基本可以看作是housekeeping，做loading
control。所以应该是极强，至少也是很强。在默认设置下，应该是强信号，甚至是过
饱和。这种背景还算低，但actin信号几乎没有的情况，说明western本身有问题。
如果其他步骤没有出差错的话，最大问题就是二抗-milk组合出了问题。
odyssey是不推荐使用奶粉的。就是因为它太灵敏，牛奶甚至普通bsa的背景太高。
因为很多公司这么做，所以我怀疑licor也可能会这样。licor一向推荐自己出的二抗和
blocking buffer。尤其是后者，比牛奶和bsa都贵很多，是他们公司主打消耗品之一。
他们非常不愿意见到客户用廉价的奶粉。别家出的二抗他管不了，但是自家的二抗，很
可能有什么技术，... 阅读全帖 |
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r*****m
发帖数: 231 | 3 我个人的经验是LICOR的灵敏度介于ECL pico和femto之间，很弱的signal用LICOR看很
吃力，因为背景还是太高了，不像ECL，只要操作得好背景应该为0。
不过我觉得LICOR最要命的是二抗的specificity问题，IP下来的sample用不同species
的二抗竟然能看到很强的IgG，这个让我直接怀疑用它同时做两个primary的
specificity可靠性。。。事实上我也确实遇到过一个channel的signal透到另一个
channel的情况，不过不知道是荧光的bleed through还是二抗的cross－reactivity？ |
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d*******e
发帖数: 110 | 4 我一直在用Licor Odessey，觉得Licor Odessey 的灵敏度非常的高。用的是它家的二
抗，稀释到1:10000都能得到很好的信号。我一直用5%的脱脂奶粉block， 有时候背景
比较强，但总体上好过得去。哪位好人能提供一下Licor Odessey自家的blocking
buffer 的配方，老板不同意买这个blocking buffer.
带， |
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d****u
发帖数: 1553 | 5 其实licor这个机器对懒人来说是最大的解脱，就像我，从来没压过片冲过片，以前直
接是cool-CCD成像，后来就是licor了，省事啊！不用培训，只要是个会做western的就
能扫膜，上手快啊！ |
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j********r
发帖数: 156 | 6 不习惯用licor, 但实验室没有胶片。问楼上几个问题，
1. Are pvdf and nitrocellulose equally okay for licor?
2. 每次扫4x7的膜，选169um的分辨率，要4分多钟，这正常吗？
3. 是直接把膜从buffer里捞起来放上去，还是要把膜先弄成半干状态？
多谢！ |
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s**********o
发帖数: 14 | 7 我一直用Licor，我的经验是他的灵敏度要比ecl高。
我增经用过低于5ug的total protein上样，actin的结果也还是非常好。
要trouble shooting别人的问题，总是比较难。根据你的介绍，
我不知道blocking buffer是不是问题，在licor的manual里，
他有专门的blocking buffer的配方的，我一直用那个，配完后分装冻起来。
用milk和BSA据说都会减弱或者产生比较强的background。我们旁边的实验室
也有人用milk,但他们2抗用的浓度要大，1；2000。我一般用1：10000。
还有一个问题就是，不知道你的2抗是不是长期放在4度，时间太长会显著的降低他的灵
敏度的。
分装，放在4度尽量在1-2月内用完，最好。
别的，我也不知道了，你先试试，回头UPDATE一下进展。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 8 你的那种绿色的膜背景很高啊，不知道你用的是不是Nitrocellulose?
如果你不小心用错了PVDF，会导致背景非常高！
另外，最好不要用牛奶。我的经验是，要么就用牛奶里面提纯的那个casein，
那么就乖乖的用Licor 产的blocking buffer。直接用牛奶的话也很容易导致
背景很高。
在我的经验里，Licor Odessey 的灵敏度比Femto kit稍微低一点点，但是
绝对比普通的ECL强的多 |
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s******r
发帖数: 2876 | 9 谢谢，有空我再试一下，二抗跟别人借的，也可能有点问题。
我一直用Licor，我的经验是他的灵敏度要比ecl高。
我增经用过低于5ug的total protein上样，actin的结果也还是非常好。
要trouble shooting别人的问题，总是比较难。根据你的介绍，
我不知道blocking buffer是不是问题，在licor的manual里，
他有专门的blocking buffer的配方的，我一直用那个，配完后分装冻起来。
用milk和BSA据说都会减弱或者产生比较强的background。我们旁边的实验室
也有人用milk,但他们2抗用的浓度要大，1；2000。我一般用1：10000。
还有一个问题就是，不知道你的2抗是不是长期放在4度，时间太长会显著的降低他的灵
敏度的。
分装，放在4度尽量在1-2月内用完，最好。
别的，我也不知道了，你先试试，回头UPDATE一下进展。 |
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s******r
发帖数: 2876 | 10 是PVDF，millipore non-fluoscence的，用intensity 7.5，背景已经很高了，
anyway，想省钱大概是不行了。
你的那种绿色的膜背景很高啊，不知道你用的是不是Nitrocellulose?
如果你不小心用错了PVDF，会导致背景非常高！
另外，最好不要用牛奶。我的经验是，要么就用牛奶里面提纯的那个casein，
那么就乖乖的用Licor 产的blocking buffer。直接用牛奶的话也很容易导致
背景很高。
在我的经验里，Licor Odessey 的灵敏度比Femto kit稍微低一点点，但是
绝对比普通的ECL强的多 |
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f*********r
发帖数: 1233 | 11 licor odyssey这款扫描仪器加软件是（半）自动调节的，但智能程度有限。人为造成
了“背景强”的假象。在下面的解释过程中，我排除曝光过度的过饱和情况，只说一般
情况。
在扫膜的时候，信号强度可大致分为三个层次：特异信号（也就是我们要的条带），膜
背景，玻璃背景。
扫膜的时候，odyssey会自动调整图像亮度对比度，把信号最低的地方作为背景。我们
要自定义一个扫描范围，横竖各多少格。如果范围定义得过大，那么势必要扫到膜外玻
璃空白部分。而机器会把这个玻璃背景作为背景强度，而膜背景就会被当作信号来处理
，显示得很亮。这就是为什么“背景强”。如果自定义扫描范围的时候，尽量排除玻璃
背景，软件会把膜背景当作背景，背景强度就会比较接近0。
1.2版的处理比较傻瓜，扫描后即使crop掉玻璃空白，背景也不会自动调整，你必须自
己手动调整。2.0版就有所改进，crop掉多余部分，它会自动重新调整背景强度。
不管是不是自动调整，背景强度和信号强度的关系是不变的。不会影响最终的定量分析
。 |
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d****u
发帖数: 1553 | 12 胶片依然是目前最灵敏的检测方法。但是根据我的比较licor做出来的图像在分辨率，
图像质量，操作难度上都大幅胜出。 |
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l*******r
发帖数: 39279 | 13 Licor odyssey这种扫描仪好在哪里？是灵敏度比一般scanner强？科普一下，貌似比较
fancy |
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g*********5
发帖数: 2533 | 14 after we bought the Licor, I just dumped the film. goodby, darkroom. |
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f*********r
发帖数: 1233 | 15 1, 没做过系统比较。个人认为或者说感觉，取决于抗体在膜上的表现，当然与buffer
有一定关系。跟机器本身关系不大。
2，正常。licor其实就是光学扫描仪。最初的扫描仪速度也不快。如果有更多同类产品
参与竞争，几秒钟就扫完整版的高速机器会很快出现。目前不快，主要还是垄断在作怪。
3，一定要全湿。放膜之前要在玻璃上加水。一来，是为了赶走气泡，二来，水层可起
到类似“全反射”的效果，增加通透率，减低散射。就象显微镜的油镜。 |
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s******r
发帖数: 2876 | 16 多谢你能抽空指点，
我block用的是5% milk in 1xTBST,
2抗之前步骤都相同，同一张膜剪两半。
2抗也是5% milk,1xTBST, 室温1hr，
TBST洗完了后，PBS洗两边，膜完全晾干后scan.
1), 2Ab是Licor自己的IRDye 800CW Goat anti-Mouse，#926-32210
1:5000 in 5% milk.
2), 双色彩图700 intensity 2.5, 800 intensity 5.
800单独扫描参数是 intensity 7.5.
sensitivity都用的缺省值5。
3), 上了四个图，ECL扫描的图，彩图包括700和800 channel，参数如上，
800单色图，参数如上，800灰度图，从800单色图export，没有压缩。
主要比较第一条lane。
因为只用了一种一抗，所以700灰度图应该没什么用。
麻烦帮着诊断诊断。 |
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m*****l
发帖数: 28 | 18 看你probe什么蛋白了。 有的抗体在Licor上work的不如ECL， 有可能是二抗的问题。 |
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d****i
发帖数: 2346 | 19 Licor相对方便，但是太敏感，背景太高。如果你要strip就更麻烦，远不如ECL的strip
后好用。 |
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g*********5
发帖数: 2533 | 20 用了4年licor了。感觉比ecl灵敏。
如果用pdvf （我一般只用nc），二抗中加点sds可以降低背景 。
actin不出来，原因应该是二抗问题。
还有，我从来不干膜，总是湿扫。
他家有专门的strip buffer，管用。
1:5，但是我用1：10，室温20分钟，4度两小时。
tbst洗4遍，可以直接用别的一抗。
有时候tubulin去不干净。 |
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f*********r
发帖数: 1233 | 21 总体来说，licor odyssey还是不错的。荧光二抗不是问题。300块100ul可用几个月一
年。
好处是大大节约了步骤和时间。不需要底物反应和底片曝光。
最大的好处，上面都没有提到。licor可以同时识别两个波长的荧光。假设你需要计算
蛋白X的磷酸化比例。你可以在同一张膜上同时孵育两种抗体：总x，磷酸化x。当然，
这两种抗体必须来自两种动物（比如小鼠和兔）。然后同时孵育两种二抗。这两种二抗
要连接不同荧光，一个波长680（红），另一个800（绿）。
扫膜将同时显示红绿两种颜色。定量时划一个框，软件会显示框中红绿荧光两个值。两
者的比值真实反映磷酸化比例。任何其他单色wb定量算出的比值都是估算值。
不仅如此，licor扫描出来的彩色条带还可以从视觉上很直观地显示磷酸化比例。假设
磷酸化x标记为红，总x标记为绿，那么磷酸化高的条带偏红，磷酸化低就偏绿，磷酸化
水平适中就显示黄色（软件自动设定红绿叠加结果为黄）。发文章的时候，视觉上比显
示两遍黑疙瘩（一个是总x，另一个是磷酸化x）好。
另外，此设备对gfp的荧光敏感，凡是gfp需要定量的样品，包括细胞培养皿，甚至小鼠
（或其器官）都可... 阅读全帖 |
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t*****r
发帖数: 4431 | 22 有不少有用的信息，谁有时间和兴趣慢慢读.
By DAVID LASKIN
Published: March 24, 2011
SPRING comes early to Seattle and lasts long. By the end of February, the
rains relent and pastel shades of plum and narcissus initiate a progression
of color and scent that lasts months. But new flora is not the only thing
popping out of the ground in Seattle these days. Seemingly overnight, whole
swatches of downtown and close-in neighborhoods — notably South Lake Union
and the Pike-Pine Corridor — have transformed themselves into ... 阅读全帖 |
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f*********r
发帖数: 1233 | 23 我比较喜欢这个公司的二抗。条带清晰，特异性高，交叉反应比较少，背景干净。价钱
不贵。500ul还不到200块。
不过用licor机器，blocking的时候和稀释抗体的时候，最好用专用的blocking buffer
。一般是licor自己出的buffer，或者是rockland的buffer。用albumin配或者用奶粉好
象效果不太好。好在buffer可以回收再利用。 |
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a****d
发帖数: 1919 | 24 前段时间版上讨论 Licor Odyssey，请问熟悉imager的各位，licor odyssey， storm
imager(GE), 还有Bio Rad的imaging system， 哪个最好用？
我一直用film，但是最近暗房被拆了，杯具。。。lab里面有一台 Bio Rad 的imaging
system,我很不喜欢用，感觉远不如film sensitive，而且背景也高。
现在考虑是否有必要催boss换一台imaging system做western blotting，请熟悉这方面
的推荐一下。 |
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C*********r
发帖数: 4 | 25 对, 你说的灵敏度是我们倾向选LAS的原因。我们也没有用过Biorad的。对于Licor，
记得原来实验室有Fuji LAS3000后, 就没有人用它了. licor 饭不要喷我哈。。。。
但是Fuji LAS3000现在没有卖的了,4000又太贵了. 不知道２万能不能拿下4000mini
， 如果能就好了. |
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C********e
发帖数: 329 | 27 是的，我说的那个红外激光扫描成像系统就是LICOR ODYSSEY.但功能好像没有
flurochem多。如果要用猪、鸡等动物的荧光二抗，不知是否能买到？而且不能用ECL吧
？ |
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s******y
发帖数: 28562 | 28 tween20?
Licor的技术人员特意的跟我们说过，不许在抗体溶液里加这个。
洗液里加这个倒是没有问题。
另外，我有点好奇的是maleic acid 到底是干什么用的？是抗菌剂么？ |
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s******y
发帖数: 28562 | 29 你们实验室可能有钱吧。我们非常抠非常抠。我们的抗兔抗鼠二抗都是Licor送的免费
样品，
就那么一小管。一直用了两年了。
其他抗体，要买之前都要缠老板缠半天。
blocking buffer 我不喜欢回收的，因为担心长霉菌。缠了老板半天终于同意我买了一
大瓶，
但是每次只能用1mL. |
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s******y
发帖数: 28562 | 30 你应该是记错了。tween20会干扰一些抗体的结合，在某些情况下会降低特异信号。
当然大部分情况下是无所谓的。
如果是用HRP, NaN3是绝对不可以用的。不过Licor就无所谓了。
我刚才查了一下google, Maleic acid 的确是抗菌剂，和背景没有太大关系。 |
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t******y
发帖数: 716 | 32 和用film相比，lico的检测敏感度会更好吗？ |
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f*********r
发帖数: 1233 | 33 我个人认为，敏感度高很多。你可以轻轻松松就把一条弱带调得很强。 |
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f*********r
发帖数: 1233 | 34 同意。
新兴技术终将淘汰旧技术。
再说，柯达就快倒了。再过些日子，想用胶片都没有地方买了。 |
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f*********r
发帖数: 1233 | 36 都数字化了。从x光平片、到ct、核磁，一水的联网在线观看。就连给病人的copy都是
cd。 |
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d****u
发帖数: 1553 | 39 灵敏度比用cool-CCD扫出来的强，分辨率高，可以做双色检测，没有底物的消耗，简单
容易上手。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 41
大部分厂家的PVDF 有比较强的背景红外荧光，应该尽量避免
Nitrocellular 比较好。
正常，就是这么慢的
理论上没有区别，但是实践上，弄成全干最好。如果是湿的话，容易弄出小
气泡，扫描出来后会形成亮点。
半干的话我不放心，因为我担心湿度对荧光强度有影响。所以我一般都是
凉干过夜 |
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d****u
发帖数: 1553 | 42 干的湿的我都试过，对信号强度影响不大。不过大概国内实验室环境不够干净吧，我把
膜放干了后上面总是会有些灰尘啊啥的，扫的时候反而会有一些亮点。所以我都是把膜
湿着放上去。当然还是要稍微控一下。气泡问题很容易解决的，放膜的时候稍微小心点
就好了。 |
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S*****s
发帖数: 287 | 44 Millipore 的 Immobilon-FL 是降低了背景荧光的 PVDF 膜，也是在 Li-Cor 网站上卖
的膜。对于 2 KDa 左右的小蛋白也可以用 Immobilon-PSQ，背景荧光也很低。不过我
们实验室有人曾经拿错过 Immobilon-P，杯具啊。 |
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S*****s
发帖数: 287 | 45 如果你说的是膜和二抗的话价格和普通 HRP based western 差不多，不过它不需要显
色剂，Ladder 的用量也比普通的 Dual color ladder 少，综合下来花费还便宜一点。
这个系统最大的优势是可以把两个不同 species 的抗体放在一张膜上染色，如果抗体
选的适当，一张 Odyssey 膜等于是两张 ECL 膜的结果，试剂花费就少很多了。我上
个月跑了三十块胶，多个抗体同时染色然后用 Odyssey 看结果，得到的数据量起码等
于用 ECL 跑五十块胶。 |
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j********r
发帖数: 156 | 46 Thanks a lot for the great points. I am very new to the fancy machine (which
I really don't like), and I am not sure what is the right way to handle the
software after the scanning is done.
The procedure I follow is
1. In the software, convert to grayscale
2. Export to TIFF
Do I miss anything, such as any tricks to make the blots look better? Thanks
, |
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d****u
发帖数: 1553 | 47 在软件里你不用把图像翻转成灰度的，直接导出彩色图像就好了。如果你想要灰度的图
像，直接去找扫描原始文件，里边
有一个700.tiff有一个800.tiff，只要把你相应波长的文件打开，用PS翻转就可以了。
which
the
Thanks |
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f*********r
发帖数: 1233 | 48 没有什么right way。只是个人喜好。我比较喜欢这样处理：
因为图像最终要输出成出版格式，也就是白底黑带的传统模式，所以调试的时候也用黑
白模式。
我喜欢背景比较干净的图像，所以尽量把背景调到纯白。如果目标条带非常弱，可以适
当把背景调重些，但最好是浅灰，而不是深灰。
我们最终目标是要比较各样品的差异。所以，通过亮度对比度调节，视觉效果最好能最
大限度突出各样品的差异。比较理想的是，最弱的带（如果确实有）刚刚能看到，最强
的带是纯黑。
在文章投稿、写grant、做ppt的时候，我们不希望插入的图像是个很大的tiff文件。输
出的时候，图像保持100%大小，存为jpg图像。在odyssey 2.0版中，还需要选择“高质
量”。
which
the
Thanks |
|
j********r
发帖数: 156 | 49 duo xie lou zhu!!
How do you adjust the background, by changing brightness/contrast? Thanks, |
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f*********r
发帖数: 1233 | 50 对，主要是亮度对比度。
还有一个是敏感度。默认设置是“线性自动”。如果用亮度对比度调节达不到理想的图
像，可以把线性自动改为“线性手动”，来手动调节敏感度。如果要更大幅度调整，才
需要用对数。
举例
上图上下两部分是同一张膜。上面亮度50，对比度50；下面亮度1，对比度75。 |
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