y*********u
发帖数: 183 | 1 What I could think of: you can run a westernblot using CHIP samples before
protenase K treatment(1/10-1/20 depend on the expression level of your
protein of interest). If you pulled down a lot of your protein of interest,
and if your procedure is clean, I see no reason the CHIP-Seq wouldn't work
if your protein is indeed a DNA binding protein.
In worst case scenario you should still be able to get lots of strong peaks
which is particularly useful to you since your problem is that you didn't
have... 阅读全帖 |
|
y*********1
发帖数: 46 | 2 Search Pubmed with "ChIP-Seq" and "autoregulation" |
|
|
c*********r
发帖数: 1312 | 4 BGI is good. I'm currently doing 21 RNA-seq samples with them.
So far the pricing is good. Turn about time kind of depends on your payment
speed... |
|
m******5
发帖数: 1383 | 5 似乎只要他们公司没有登记在案的Chip-Seq work的antibodody的transcription
factor都要从这个service开始 |
|
m******5
发帖数: 1383 | 6 问问做Deep Seq多的同学，Deep sequencing中出现的小peak大家都怎么处理呢？
所谓小就是bigwig的scale bar大概就10左右，看reads构成这个peak的reads也就几十
个（不过扣除redundant reads）。
有一些小peak意义还很好的，Chip-qPCR还能重复出来。
这个问题大概做low expression transcription factor的同学经常遇到吧？ |
|
f*****h
发帖数: 228 | 7 版上大牛，我现在想分析一些non strand specific RNA-seq数据，不知道在用Bowtie
，TopHat，Cufflinks是都要注意些什么，另外，这些软件都是如何区分strand
specific和non specific的数据的，是正反strand都align上吗？还是在做
differential expression analysis的时候才考虑进去，本人初入门，多谢指教。 |
|
|
|
D***a
发帖数: 516 | 9 我现在做的蛋白细胞质和核里面都有。想做CHIP－seq看看是不是直接或间接与DNA有结
合。送测序之前如何确定CHIP成功了？测一下我的抗体拉下来的DNA是不是比control
IgG高很多？或者有哪些公认标准？谢谢。 |
|
c**o
发帖数: 56 | 10 我们group有病人，分析家族数据，找到致病的位点。已经作了好多个病人了。有个人
专门和病人联系，打电话，跟他们讲分析的结果。不过一般都是whole exon seq |
|
y*********u
发帖数: 183 | 11 如题
做了几批一个transcription factor的CHIP-Seq
出来的peak pattern都和DnaseI很像，是否正常？（detail都像） |
|
M********a
发帖数: 35 | 12 FAIRE，还有一个sono-seq也很类似。
我觉得如果你没有input的话就比较悬，至少igG control得有，不然的话哪些是false
positive很难说清楚，到时候reviewer估计也会问。
因为每次试验的条件会有些差别，比如reverse crosslink的时间，所以input的
variability其实差别还是挺大的。Control真的很重要。 |
|
m******5
发帖数: 1383 | 13 I am just reading the sono-seq paper you refereed to
http://www.pnas.org/content/106/35/14926.full.pdf+html?with-ds=
How come a paper describing an artifact could be published on PNAS…………
anyhow, it appears that this paper actually taught us to ignore the bias in
input because they found such bias irrelevant to the baseline level of
binding in IgG (as those regions enriched in Input were not enriched in the
IgG control )
false |
|
y*********u
发帖数: 183 | 14 前辈你做的Chip-SEQ都是基于什么的？histon还是transcription factor？ |
|
k***a
发帖数: 636 | 15 请问你设想的tool的优势是什么？做RNA-seq的哪一方面？DE, novel transcript?
更重要的一个问题，Tuxedo suite可以拿来赚钱用么？我对这个也好奇 |
|
r*****q
发帖数: 216 | 16 设想的优势就是不用学任何programming，完全不用写 command-line code 就跟用
window desktop application 一样 鼠标点就行 就可以完成RNA的perprocessing分析
。 提供在windows 上run的solution。 使用业界标准的 processing tool
赞先只做 RNA-seq的 per-processing 包括 QA mapping 到output count data.
Tuxedo suite 用的时候也不是直接就能用啊。 你要学学怎么用。 再把相应的gtf 和
fa 啥的都找好。 然后你有multiple sample的时候 code 也得小改一下。当然 做完一
次之后 估计就不会再动了
请问您是专门做bioinformatics的吗？这个tool的target user 可能是lab里面的
postdoc 懂一点bioinformatics 但又需要开始分析这样的data |
|
r*****q
发帖数: 216 | 17 RNA-seq process完了之后 出来 count data 基本就和 gene expression 一样的 很
多原来做microarray的 统计方法 可以直接用。 找 differently expressed gene/
feature selection 的话 这个很容易。 我原来就是做downstream analysis的 所以不
担心这方面。很多功能都能加进去 还有visualization的东西。 关键是前面的 data
要process 好 然后就是 annotation 要好才行 要不然 做出来的analysis result 都
是没用的。
我设想的是 给那些 没有顾专门的bioinfo的人的lab 用的。 一般有钱请专门的
bioinfo的人的lab 我觉得都是很有钱的大lab了 难道我想当然了？
合作的话 是可能 但一般合作的话 效率都不高 很慢 天天meet 而且找到合适的
partner 也不容易吧 如果可以有个不贵的product 然后自己动动鼠标就能用 你觉得
大家会perfer自己做吗？
呵呵 现在是晚了点 估计找钱很难了 但如... 阅读全帖 |
|
r*****q
发帖数: 216 | 18 这个确实是我的失误 不过还好 现在在这里知道了clc
PS 请问 您是base在美国吗？ 在这边的bioinformatic 相关的conference里好像没怎
么看到过这个clc 公司来做推广。 不过软件确实做的不错。 而且在google scholar里
面search了一下 也确实有很多的citations. 这里没什么人用Partek or Bina啥的?
我的impression是 做rna-seq 都是用 bowtie tophat 啥的 到处都在宣传 感觉是公认
的。 variant call的话 就是gatk 使用商业的aligner的话 我以前的感觉是不被大众
所接受。这点可能是我自己的错误观点
IPA确实是一个非常好的例子 算法的话 做统计分析的人都不看不起 但是我自己觉得
IPA厉害的地方就是 他们的database up to date的annotation 这个很重要 没有这个
做出来的analysis都没用。所以大家也都在用IPA。 而且大部分的好的annotaoin 和
pathway的 database 现在都商业化了。 我觉得可能是因为... 阅读全帖 |
|
D*a
发帖数: 6830 | 19 单细胞的都能做了，3000个不少了。kit不熟，直接问做rna seq的地方吧，如果他们不
知道，就问问他们跟谁合作做过这种然后再去问那个实验室。别自己闷头瞎搞。 |
|
c*********r
发帖数: 1312 | 20 理论上够了，关键看你用什么试剂盒来做library。和有经验的sequencing facility交
流交流。
测低浓度RNA不要用nanodrop，用Qubit HS(High Sensitivity)或者bioanalyzer。
我去年暑假做的，500 ng可以作常规的RNA-seq，而且当时担心Ribo-Zero那一步会不会
有很多损失。实际上现在需要的RNA量可以比这个低很多。
单细胞的测序也开始流行，就是成本高。。。
buffer |
|
s********8
发帖数: 619 | 21 研究了半天stranded RNA-seq protocol,彻底晕掉了~~
illumina的kit是在second strand cDNA中引入dUTP,然后amplify library的时候这条
链不扩增.
NEBnext的protocol是用USer 酶把这条链degrade,然后再扩增
这俩有什么区别??
我准备用KAPA的kit,因为这个kit不带adapter,需要自己买adaptor,本来想订NEB的
adapter的,但是NEB的protocol又不一样...彻底糊涂了,哪位大侠指教下?不胜感激! |
|
Z******5
发帖数: 435 | 22 最近在做一个转录因子，发现UCSC上有ChIP-seq的数据，想弄下来做个全面分析。
现在能做到的是：从ftp上下载bigWig数据，然后用bwtool过滤，然后转成Wig格式，然
后再转成Bed格式，然互再提交到GREAT做分析。
问题是：过滤后的数据转为Bed有 300M 左右，但是GREAT只能提交50M且不超过50000个
element，这样上传的文件基本只有5M左右，或者更低。
请问有啥好办法能够一次性注释300M或者更大的Bed文件呀？ |
|
C*********m
发帖数: 213 | 23 我有个蛋白，平时都在核外，某个条件下跑到核内成为（疑似）转录因子。有两个组以
前做过转录活性，但是文章比较老了。我们自己也做过EMSA，看到和DNA的结合，也有
核内核外成像定位的数据。但关键是不能确定是否真的是转录因子。现在的数据也就够
个JBC之流的杂志。和两个实验室试图合作做Chip-Seq，但是对方都不卖力，迄今没有
进展，很失望。请问版上有哪位大哥大姐可以做这方面的实验，短期内能出一些数据，
可以合作写文章。
有兴趣的请私信联系。 |
|
a******r
发帖数: 786 | 24 I think you need good antibody for ChIP seq
not sure if your protein of interest has good Ab for ChIP |
|
m******5
发帖数: 1383 | 25 in such case, I guess it would be sufficient to just include a 'no epitop'
group for Chip-Seq.Do peak calling against both input and non epitop.
a |
|
m******5
发帖数: 1383 | 26 做个chip-pcr总是疑神疑鬼的
不像chip-seq, sites是否可靠和边上background和input,igG control一比就清楚了 |
|
k*****n
发帖数: 323 | 27 qpcr'手一抖'就什么结果都能做出来了╮(╯▽╰)╭
好多烙印的qpcr结果都不能信。seq手抖就不好弄了 |
|
a******r
发帖数: 786 | 28 我觉得你这样的做PCR 等于瞎子摸象，还不如先花点钱做几个seq，看看哪里有
enrichment再用pcr去做treatment comparison。
情况 |
|
a*******g
发帖数: 33 | 29 新手刚开始做这块，想顺便请教大家这两者在fold enrichment方面的问题。我用chip
－pcr测得chip sample在该TF的经典target上，跟ip相比有上百倍的变化。同样的样品
送去chip seq，虽然经典target依然是变化最大的，但是fold change只有20几倍。这
是为什么呢？ |
|
m*********D
发帖数: 1727 | 30 到最后那个cycle,不会每个DNA strand都会被用来作template吧？我从gel下来了，送
seq,就那个mutation区间不清楚，所以有此一问。还在作第二次酶切呢。
不就是想省事么。mutant band到还行，没问题。这个不酶切的WT band让我头疼呢。
ta |
|
|
x*****e
发帖数: 309 | 32 其实更应该担心是ＤＮＡａｓｅ能否起作用，如何检测ＤＮａｓｅ起作用。有时候问半
天还不如自己做一下，生命短暂，用ｋｉｔ吧，尤其是你的样品是用来做ＲＮＡ-seq。
净。 |
|
n***w
发帖数: 2405 | 33 We work with tiny mouse tissues and we use RNeasy plus micro kit.
Just followed the instructions and worked fine for RNA-seq.
Qiagen has so many kits designed for so many tissue types. Check their
website. |
|
v********a
发帖数: 646 | 34
The RNeasy Plus Mini Kit purifies up to 100 μg total RNA (>200 nt) from a
single extraction with efficient gDNA removal.
RNAs over 200nt are eligible for RNA-seq? |
|
m******5
发帖数: 1383 | 35 hypothesis是 treatment后比treatment前的某个cell lineage更接近fibroblast like
cells. 已经得到这两个条件下的transcriptome data(RNA-Seq). 要如何test此
hypothesis? 求教入门级的和高级的技巧。 |
|
b******s
发帖数: 1089 | 36 带荧光的细胞，估计最多只能拿到几百个。在国内做RNA-seq，国内小公司要求扩增一
下。
对结果影响大吗？
谢谢！ |
|
O**********a
发帖数: 317 | 37 不就是 SMARTer Kit吗？
能用来测单细胞到一千个细胞。你的情况是测几百个细胞，应该没问题吧。
RNA seq要测至少6个生物学重复。 |
|
k***a
发帖数: 636 | 38 哪里说RNA-seq 要测至少6个生物学重复? reference please |
|
|
y*********1
发帖数: 46 | 40 可以试一试ChIPmentation protocol, 文章发表在十月份的 Nature Methods 上. 就
是在ChIP-Seq 中加一步Tagmentation, 用Illumina的Nextera kit. 5万个细胞应该够
了. |
|
d****u
发帖数: 275 | 41 omics的方法里都有技术重复和生物重复；你的这个方法其实是2个combine起来，数据
variation小，其实统计上是站不住脚的，而且有些traits可能看不到了，当然如果是
验证型的实验，估计问题不大；
RNA seq要的量小，技术门槛低，又不贵，至于这么设计么？Proteomics的样本这样
pull起来到比较常见，你可以看看Pantey的文章。 |
|
s******s
发帖数: 13035 | 42 从来没听说过，会不会别人说multiplex，lz没听懂？
倒是DNA-Seq，目的是找mutation, 测多个library确实有好处，不过也很少
混合library放一块测序的，因为最后有算法上的问题。 |
|
s******s
发帖数: 13035 | 43 从来没听说过，会不会别人说multiplex，lz没听懂？
倒是DNA-Seq，目的是找mutation, 测多个library确实有好处，不过也很少
混合library放一块测序的，因为最后有算法上的问题。 |
|
m******5
发帖数: 1383 | 44 ChIP-Seq 就是agroase beads好用稳定
我也不知道为什么。也曾经有和你一样的问题，后来决定不折腾了，结果能用稳定就行
tissue |
|
k*****n
发帖数: 323 | 45 try washing your Dynabeads with PBS 0.5% BSA 3 times, then incubate
antibodies in PBS-BSA for two hour. After IP, make sure resuspend beads
totally during each washing step. I never using sperm DNA. I would suggest
you using Pol II monoantibody 4H8 as positive control. Several steps are
critical for ChIP, 1, crosslinking, always using fresh FA, like 16% FA from
Thermo. for cells 15 min crosslinking with rotation would be enough, quench
with 0.125 M glycine for 1 min. 2 sonication, try Branson so... 阅读全帖 |
|
k*****n
发帖数: 323 | 46 For Seq, don't using any sperm DNA! it will saturate majority of your reads,
although it won't map to your genome!
for qPCR it might be fine. |
|
f******k
发帖数: 856 | 47 我试了他们的iDeal ChIP-seq kit for Transcription Factor。 也是最后DNA yield
高，他们也是用的magnetic beads.... |
|
x*****d
发帖数: 704 | 48
1.
自己按照GSEA网站上gct的格式把你的RNA-seq改成gct格式，比如这样
#1.2
20000 6
Symbol Description WT1 WT2.。。。
ACTN1 Actin1 100 100
你可以用FPKM来做GSEA。gene symbol必须大写！因为GSEA用的gene set都是大小写敏
感，而且全是大写的。
2.不是必须的
3.不需要选，自己collapse by gene symbol，除掉duplicate，然后在GSEA界面那里吧
collapse的选项关掉
4.如果你的gene name是official gene symbol的话那就是MSigDB的gene name，个别
gene name可能不一样，这个你得自己去鉴别。实际做的话影响不大。 |
|
d***s
发帖数: 1062 | 49
现在Chip-seq价格多少？有推荐的公司吗？谢谢。 |
|
D***e
发帖数: 44 | 50 谢谢楼上2位的解答，那就打算用RNA-seq了 |
|
