r****o
发帖数: 105 | 1 本文献给YL
（十七）何去何从
上一章提到从大鼠肝脏提取质膜的方法。质膜准备好了，下一步就得考虑
怎么溶解质膜。最主要的问题是：用什么去垢剂呢？Dr.Lin在这一步试验里面
要求每一组中的四个人各选一种去垢剂来溶解质膜，纯化完之后再比较不同去
垢剂的蛋白质纯化效率，看看哪一种去垢剂最有效。选择去垢剂很简单，无非
是想让膜蛋白能被充分的溶解解离下来，同时又不使蛋白变性。事实上，纯化
膜蛋白时去垢剂的选择是没有规律可循，除了一些显而易见的不适和做纯化的
去垢剂(比如SDS)外，很难讲什么去垢剂好什么去垢剂不好。所以，只能具体
问题具体分析，一个一个去尝试。我们这一组人选的四种去垢剂分别是:
Triton X-100, Sodium Cholate, Chaps, 和Octyl glucoside。我选的是
Octyl Glucoside。
好了，我先来讲讲去垢剂的小常识。去垢剂其实是很大一门学问，我几年
前就花过好多力气来学习其中的一些知识，但到现在为止还是只懂了一些皮毛。
这里就权当抛砖引玉了。首先，什么是去垢剂(detergent)呢？就是同时具有
疏水和亲水两种基团 |
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r****o
发帖数: 105 | 2 本文献给YL
（十九）MDA-BF-1的启示
凝集素层析实际操作起来很简单，跟过简单的Ni柱子一样。拿到洗脱
的蛋白之后，我们就着手开始测活，分析纯化的效率和倍数。胰岛素受体
不是酶，所以测活是利用胰岛素与受体的特异结合。具体的测活步骤非常
简单，就是把I-125标记的胰岛素和纯化的组分混合然后孵育一段时间。然
后加PEG（Poly ethylene Glycol ) 6000沉淀胰岛素受体，而游离的胰岛
素不会被沉淀下来。说到PEG沉淀，Dr.Lin讲了她自己闹的一个笑话。是
这样的，她实验室发现了一个蛋白质因子 MDA-BF-1。这个因子对Osteoblast
（成骨细胞）的增长有促进作用。然后呢，她就想把这个因子的受体给找
出来。首先一步呢，就是得有一个测活方法。所以她就比照insulin
receptor的测活方法而设计了一个方法, 其中连PEG沉淀都是一样的。
结果呢，这个测活试验完全失败了。问题出在PEG沉淀这一步。PEG作
为一种多元醇，可以想像为一种“分子海绵”，可以吸附水分子。这样样
品中蛋白的有效浓度实际变大了好多，容易出现聚集然后沉淀的现象 |
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p*****n
发帖数: 981 | 3 ☆─────────────────────────────────────☆
elity (elity) 于 (Sun Feb 4 12:10:55 2007) 提到:
实验室要新添一台纯化蛋白质的仪器，不知道大家觉得什么样的较好。现在在考虑的有
： ActaPrime, BioRad 的 BioLogic DuoFlow, 以及ISCO的Foxy。不知道大家有什么建
议。 谢谢。
☆─────────────────────────────────────☆
anoia (阿诺) 于 (Sun Feb 4 12:16:28 2007) 提到:
FPLC?
☆─────────────────────────────────────☆
goodpop (姚期智老师对我说不要自满) 于 (Sun Feb 4 15:09:47 2007) 提到:
蛋白纯化系统还是akta系列最好
有钱就买purify,甚至explorer
钱不够就FPLC
prime这种破烂货就别要了
你要是买了prime,大部分prepacked columns就别想用了
只要钱 |
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C*********m
发帖数: 213 | 4 代友发文，大家不要来问我细节
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
中国农业大学生物学院想招一个独立做蛋白质晶体学的PI，解决住房和户口问题。 有
意者请联系 陈老师 或者直接投简历到我校生物学院。
联系方式： c***********[email protected]
Tel: (86)-10-62734078 陈老师
<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<
是北京海淀区圆明园西路那个农大。据说待遇和启动资金要和系里的头具体谈。具体做
的方向好像也没有什么限制。 |
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J********3
发帖数: 3151 | 5 陈忠周自己不就是搞蛋白质晶体的PI吗，难到他要找个打下手的PI？ |
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x******e
发帖数: 1428 | 6 请问如果要一次性预测很多蛋白质序列（>10,000）的二级结构，有什么比较好的软件
可以用呢？我现在在试Prof这个软件，不过ms比较麻烦，虽然费了一番周折总算装在
Linux上了，但是它的documentation也不太清楚，或者我还没找到？
刚刚开始做这个，还在摸索阶段，请大家多多指教，谢谢了！ |
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E*C
发帖数: 1629 | 7 最近看的文章，已经敲掉的蛋白质 ，肿瘤种植之后，又表达了
咋回事涅 |
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o**4
发帖数: 35028 | 8 体内确实太复杂了，人算不如天算；
southern blot验证有啥用？基因组没问题了，蛋白质有可能还是会被western检测到吧
原因 |
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c*****e
发帖数: 436 | 9 能具体说说这什么含义麻？
我的蛋白质长细菌了？变性了？
什么是aggregate, 为什么要aggregate？这是从何判断的呢？
谢谢你！ |
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c*********n
发帖数: 305 | 10 实验上 怎么测量水溶液中蛋白质的偶极子(dipole moment)? 水是极性分子，会不会有
干扰？需要哪些实验设备？谢谢！ |
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c*******y
发帖数: 161 | 11 Jalview是否可以把大量的cDNA alignment直接translate成protein sequence
alignment呢?我有一百多个序列需要转为蛋白质进行比对,不想一个一个的翻译,可否同
时翻译进行比对呢?多谢了! |
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c*******y
发帖数: 161 | 12 各位朋友，我刚开始接触生物信息，想对两株细菌的全基因组序列和蛋白质序列进行比
对，找出两株细菌之间的差别，有哪位朋友知道什么软件可以解决这个问题，并请说明
一下具体怎么安装、怎么使用?多谢了,我的邮箱g***********[email protected] |
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R*******N
发帖数: 7494 | 13 蛋白质折叠后的3D结构是用什么方法测定的？是测分子的位置然后重新人工组合么？ |
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m****n
发帖数: 2754 | 15 氨基酸有几十种
分为左旋和右旋
构成生命所需蛋白质的氨基酸
几乎都是右旋,只有甘氨酸是左旋的
有什么理由么？ |
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m****n
发帖数: 2754 | 16
我是想问
为什么只有左旋的才能构造生命蛋白质 |
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l*****a
发帖数: 38403 | 17 【 以下文字转载自 TrustInJesus 讨论区 】
发信人: ainosunshine (mecca), 信区: TrustInJesus
标 题: Re: 再聊进化论：热运动组装第一个蛋白质
发信站: BBS 未名空间站 (Sat Sep 10 22:03:42 2011, 美东)
查了一下这个journal的impact factor只有2.3 http://www.springer.com/life+sciences/journal/11084
一般来讲生物学的普通质量的文章impact factor也是大于8的。像science,nature,都
是30以上的。如果只有这么低的impact factor，我觉得，这样的文章是不会被well
recognized.
从有机化学来讲我谈谈对作者所设计实验的看法。
"Here we show that RNA-like polymers can be synthesized non-
enzymatically from mononucleotides in lipid environments."
这个又说明什么问题呢？首先... 阅读全帖 |
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E***u
发帖数: 60 | 18 请教一下，在手上只有蛋白细胞表达质粒（以及其修饰点突变质粒）的情况下，怎么证
明某个修饰影响蛋白质turnover速率？
需要一个最直击要害最 convincing 的实验 |
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c****g
发帖数: 93 | 19 觉得做个同位素标记的蛋白质从头合成实验以及CHX处理看不同时间点蛋白的量怎样呢？ |
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k******0
发帖数: 1073 | 20 谢谢建议。
我的想法是如果结合位点更多的话，需要更多的能量to disrupt the protein
interactions. 我有最少结合位点complex作为对照。
我不知道if there is a thermo effect.
我的结合蛋白太小了，只有15kDa，K and R rich， 进行trypsin limited digestion
好像不好用胶检测。没有MS仪器。
有没有什么光谱检测可以快速检测蛋白质相互作用情况？ |
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k******0
发帖数: 1073 | 21 多谢如上建议，听起来都是复杂的技术或工作量大。
决定做活性分析了，希望完全结合的复合体对底物更有选择性。
确认后纯化蛋白质结晶长晶体。 |
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p*u
发帖数: 2978 | 22 有没有在线的蛋白质二级结构的数据库啊？如果是align好的就更好了。
另外，如果没有现成的数据库，用什么软件做预测比较好啊？
谢谢各位大虾～ |
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m******5
发帖数: 1383 | 23 首先，这个蛋白的功能分类是什么 ？ 如果是transcription factor那么进核很正常
主要还是看之前对这个蛋白质的功能分类和报道才知道是不是big deal。
其次，我觉得IF可以放在第一步做，分核质的protocol经常有假阳性假阴性分不干净，反而不如显微镜下看结果可靠。
还有楼主internal control用的是什么？一般用tublin作cyto的control，这个比较可靠。
不过核蛋白control大都不可靠，即使有leakage往往也看不出来 |
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j***w
发帖数: 938 | 24 我越来越对研究生物蛋白质感兴趣了，想拿到博士学位后再读一个生化博士，专门研究
蛋白质功能和结构。做生物的都知道，想取得不错的成果，除了自身努力外，与实验室
的水平分不开。所以，想听听各位的意见，有没有了解这个的，谢谢先！ |
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h****k
发帖数: 182 | 25 蛋白质序列已知，可以做哪些生物信息学方面的分析？？求教。。 |
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k******0
发帖数: 1073 | 26 如题。
做蛋白质和小分子的binding，小分子溶在DMSO里。谢谢指导意见。 |
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F*Q
发帖数: 3259 | 27 大多数细菌是通过binary fission来产生新个体的，其中对fission起主要作用的一个蛋白质叫FtsZ。同时有些细菌(alpha-proteobactria)是通过budding来产生新个体的，我想知道是哪个或哪些蛋白或基因对budding起主导作用。有人知道相关信息吗？
切题的回复有包子答谢 |
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y*******a
发帖数: 303 | 29 我晕，不是作业，我自己的实验。。。 自己刚刚学生物，对蛋白质方面一点都不懂。
。。 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 30 Continue to 18th floor
not only Plant but also human HIV treatment should take more care about
non coding RNAs:
References:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22312265
more
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?db=pubmed&cmd=link&linkname=pubmed_pubmed_
citedin&uid=15565159
original hint from:
http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/31644341.html
NB: if HIV treatment is not relative to 抗性和kinase
Are you sure? centuribob (Planta)
回复]
[ 20 ]
发信人: centuribob (Planta), 信区: Biology
标 题: Re: 怎样设计小实验来确定一个基因编码的蛋... 阅读全帖 |
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y*******a
发帖数: 303 | 31 我晕，不是作业，我自己的实验。。。 自己刚刚学生物，对蛋白质方面一点都不懂。
。。 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 32 Continue to 18th floor
not only Plant but also human HIV treatment should take more care about
non coding RNAs:
References:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22312265
more
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?db=pubmed&cmd=link&linkname=pubmed_pubmed_
citedin&uid=15565159
original hint from:
http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/31644341.html
NB: if HIV treatment is not relative to 抗性和kinase
Are you sure? centuribob (Planta)
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[ 20 ]
发信人: centuribob (Planta), 信区: Biology
标 题: Re: 怎样设计小实验来确定一个基因编码的蛋... 阅读全帖 |
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s*******e
发帖数: 1010 | 33 说句玩笑话，这个问题的答案永远是case by case。如果你的蛋白表达量很高（>mg/
Liter）是有可能的，但是一般都需要在亲和洗脱后加一步分子筛或离子交换进一步纯
化一下才能达到90%。如果你在蛋白质和亲和标签之间加了特异性蛋白酶（TEV，
FactorXa之类的）位点的话，可以考虑上柱之后用蛋白酶切下蛋白而非洗脱，这种情况
一般比洗脱得到的蛋白纯度高（因为相当于针对标签和酶切识别序列进行了双重纯化）
，但要小心有的蛋白结合亲和柱后对蛋白酶有抗性的情况。 |
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s****l
发帖数: 513 | 34 是一下1%的DMSO看能不能溶解你的化合物。1%DMSO一般不会让蛋白质变性。
口服药物是经过formulation的吧。
对了，你可以看一下人家弄成药物的时候是不是做成了盐形态。而你用的还是
hydrophobic的。 |
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a*****v
发帖数: 128 | 35 有核磁的文章是用1%DMSO做蛋白质滴定的么？
这个破药物，就是一个咪唑环还能带点点，其他的根本没法成盐啊...
他们做细胞实验的时候也是用DMSO溶解的。
但是核磁，真的是希望完全溶解的...
文章中说的口服药是in a vehicle contained 33.3% Simple Syrup and 66.6% 0.1 M
citrate buffer.也没说syrup的配方，柠檬水也没说啥... |
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a*****v
发帖数: 128 | 36 事实上蛋白质溶液中是有detergent的，DPC，但是还是不溶解啊
还有，我不是做细胞实验的，细胞实验中的确是用DMSO做的，这个基本已经是通用方法
了，但是做结构的还没见有人加有机溶剂的...
纯化这个膜蛋白头大啊，一个月才纯化那么一点... |
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a*****v
发帖数: 128 | 37 我现在没有蛋白质的溶液里面实验的，
光是用drug就这样了。
还没敢加蛋白呢，我的蛋白少啊,不管乱试 |
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a*****v
发帖数: 128 | 38 polysorbate(PS)-80 (Tween 80)???
为什么用PS80，他比别的detergent有什么优势？
有文献这么用么？
浓度已经很低了...基本跟蛋白质的浓度差不多了，umol级别了
PS80 |
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k******0
发帖数: 1073 | 39 1％SDS都无法溶解，这蛋白质有点生猛，是输水的膜蛋白吗？
有没有加了还原剂？ |
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l****j
发帖数: 70 | 40 knockout的mice基因型检验没有问题，蛋白质却没变化，
是抗体还是knockout有问题? |
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l****j
发帖数: 70 | 41 我从细胞中分离纯化的ER和mitochondria，检测过marker蛋白没有相互contamination，
细胞转染过 HA-tag 的 ER protein，WB验证只在ER和MAM(mitochondria associated
ER membrane)存在，纯化的线粒体中没有发现此蛋白。
在whole cell lysate用 HA-agarose Immunoprecipitation,在同一张膜上
immunoblotting 两个 mitochondria inner membrane protein（mito protein 1，2）
竟然发现和mito protein 1 有 binding,
分别在不同细胞器中的蛋白质，有可能binding吗？ |
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l****j
发帖数: 70 | 42 我发现的是线粒体内膜蛋白质Complex III, Fes 和转染进去的ER蛋白有binding，
但在ER和MAM里没发现有Complex III, Fes，
另一个线粒体内膜蛋白Complex V β 有部分在MAM，但这个蛋白应该是在matrix一侧的，
很多文献说MAM应该包括ER和线粒体外膜部分
我也想从sorting这方面入手，binding是因为受过表达蛋白影响，但是又没发现在ER有
那个binding的蛋白，
有没有可能是抗体只识别sorting到线粒体之后的片段，在ER的里要多出一段序列，所
以抗体识别不出来？ |
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k******0
发帖数: 1073 | 43 complex iii和ATP synthase都是线粒体内膜丰量蛋白质，污染的可能性很大。
的， |
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l****j
发帖数: 70 | 44 照过，
用的是ER蛋白质（RFP-plasmid）和mitotracker(green)的co-stain
但是照的不清楚,不像overlay，只是connection |
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C********4
发帖数: 308 | 45 搞技术流的人，怎么不开发新的能高通量、定量（不需标记）、灵敏度高的分析蛋白质
的技术
要是有这样的技术，得能和二代测序一样，大大推动发展吧 |
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C********4
发帖数: 308 | 46 嗯嗯，我觉得MS已经到头了，不可能再有新的突破
你说的single molecule Edman degradation会是一个有前景的呀
还有其他的高通量、高灵敏度、定量的蛋白质分析技术在开发咩 |
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C********4
发帖数: 308 | 47 嗯，是没法用二代测序技术的思想做蛋白质
但是不要局限于老的思想啊，打开思路 。。。 |
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u**********d
发帖数: 573 | 48 DNA到RNA 到蛋白质既是一个信息传递的过程，也是信号放大的过程。我倒是比较看好
单细胞质谱。 |
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b******k
发帖数: 2321 | 50 那个计划的特点是没有vision,没有科学问题
我还依稀记得，那个计划要做的东西包括肝脏蛋白质组，表达纯化肝脏富集蛋白，制作
所有这些蛋白的抗体，制作蛋白芯片，blabla。 |
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