x******8
发帖数: 350 | 1 本人比较菜，作GV3101的电转感受态细胞。懒，先过夜小培养5ml LB，在第二日下午扩
大培养又过夜，第三天早上开始作感受态，没有测od值。用10%甘油洗3次，最后重悬。
结果用一质粒验证，电转2kv，25UF，200欧密嘎，4.4ms电击时间。最后发现一个转化
子都没有。不知问题在哪？大家都是怎么作的啊？求指点，谢谢。 |
x******8
发帖数: 350 | |
g********4
发帖数: 4959 | |
a**o
发帖数: 53 | 4 脓杆菌电转感受态很简单，过夜的菌液，很浓，不需在意OD，用冷水洗5遍，（10%甘油
洗一下），10%甘油重悬。10毫升菌液可以最后重悬在500ul里。电转2.5kv, 400欧，~
7ms. 加1ml培养基，复苏2小时。对于质粒转化，涂1ul就可以得到很多colony.
【在 x******8 的大作中提到】
: 本人比较菜，作GV3101的电转感受态细胞。懒，先过夜小培养5ml LB，在第二日下午扩
: 大培养又过夜，第三天早上开始作感受态，没有测od值。用10%甘油洗3次，最后重悬。
: 结果用一质粒验证，电转2kv，25UF，200欧密嘎，4.4ms电击时间。最后发现一个转化
: 子都没有。不知问题在哪？大家都是怎么作的啊？求指点，谢谢。
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J****n
发帖数: 156 | |
h***e
发帖数: 146 | 6 >20kb的质粒是不是很难转进去啊？ 还有大家是怎么鉴定的？我每次都用酶切，不好判
断，因为本身都有农杆菌本身就自带质粒。谢谢 |
x******8
发帖数: 350 | 7 thank you guys! I feel shameful about myself after reading your notes.:)
Anyway, how about the quality of plasmid? Is there some special requirement
for it? |
x******8
发帖数: 350 | 8 And,
1. how about the difference between different isolates, e.g. LBA4404 or
GV3101 etc.?
2. Can I use the isolate that is grown on LB plate and put in 4 degrees for
2 weeks?
3. Do I need add some antibiotics, such as rafimycin or gentamycin for
GV3101 when I prepare overnight culture?
Thanks a lot. |
x******8
发帖数: 350 | 9 让您见笑了。那我降低电压试试？
您可以具体指点下不？
【在 J****n 的大作中提到】
: 被你电死了吧，转农杆菌超简单
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x******8
发帖数: 350 | 10 我的11k多，是否也是原因？找个小的试验下。
我觉得鉴定的话是否可以作pcr？
【在 h***e 的大作中提到】
: >20kb的质粒是不是很难转进去啊？ 还有大家是怎么鉴定的？我每次都用酶切，不好判
: 断，因为本身都有农杆菌本身就自带质粒。谢谢
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h***e
发帖数: 146 | 11 小的很好转的 一般只要抗性有就OK，最好抗生素浓度调高点。PCR也可以的，但是只能
检测部分序列。不过我感觉还是酶切放心，但就是容易降解，带很难分辨。
【在 x******8 的大作中提到】
: 我的11k多，是否也是原因？找个小的试验下。
: 我觉得鉴定的话是否可以作pcr？
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c*******7
发帖数: 314 | |
x******8
发帖数: 350 | |
x******8
发帖数: 350 | 14 自己上来更新下。
我重新设置了对照，使用了一个小的质粒7k左右，验证我的感受态细胞是没有问题的，
效率还可以；但是我的目的质粒是11k多点，这样的话，就很难转进去了。同一批次的
感受态，转对照没有任何问题，也就是大家说的'转农杆菌很容易‘的说法。但是我的
大质粒是很难转进去，即使转了有几个克隆长出来，效率是很低了。大家展开说说转大
质粒有什么方法吗？楼上的一个说转20k的，你作的如何？ |
h***e
发帖数: 146 | 15 >20k的效率很低，长很多的克隆有可能不对
反正我转的都不怎么好 不好验证对不对 |
