f********n
发帖数: 6465 | 1 我原来制备过一次单克隆细胞系，就是同一个质粒转染挑了15个细胞系，然后RT——
PCR，免疫染色来筛选出了一个表达很好的单克隆细胞系。
这次，因为一次要制备很多突变质粒(共8个左右）的单克隆细胞系，我实在是太累了，
累到郁闷死了。所以每一个突变质粒的转染，我就通过ＲＴ－ＰＣＲ选择后，冻存了２
个细胞系左右吧。
现在麻烦来了。
用ＧＥＮＥＴＩＣＩＮ没有死的细胞，ＲＴ——PCR也没有问题，可是免疫染色时，明
显的看到有一半的细胞没有荧光（也就是没有表达ＦＬＡＧ标签蛋白，也可以推断没有
表达我的目的膜蛋白）。
这样该怎么办啊？明显不是单克隆细胞系。 |
f********n
发帖数: 6465 | 2 方法一，从头转染，筛选
方法二，在已经有的细胞系里，挑选单克隆细胞系。
方法三，其实无所谓，接下来的实验可以接着做。
不知道我该怎么办呢？ |
f********n
发帖数: 6465 | 3 其实到底这个细胞系是不是由一个细胞由来的单克隆细胞系，本身在挑选的时候就没有办法判断阿。
我该怎么办呢？谢谢各位达人啊。 |
h**********8
发帖数: 650 | 4 问题是GENETICIN没有死， RT-PCR也对。
其中一些细胞仅整合了抗性基因？
另外，很可能筛选时就等待不够，所以有的虽然活着但丢失了目标蛋白的表达，有的保种复苏后也没了目标蛋白的表达。
极限稀释一下再挑克隆吧。
等待正解
【在 f********n 的大作中提到】
: 我原来制备过一次单克隆细胞系，就是同一个质粒转染挑了15个细胞系，然后RT——
: PCR，免疫染色来筛选出了一个表达很好的单克隆细胞系。
: 这次，因为一次要制备很多突变质粒(共8个左右）的单克隆细胞系，我实在是太累了，
: 累到郁闷死了。所以每一个突变质粒的转染，我就通过ＲＴ－ＰＣＲ选择后，冻存了２
: 个细胞系左右吧。
: 现在麻烦来了。
: 用ＧＥＮＥＴＩＣＩＮ没有死的细胞，ＲＴ——PCR也没有问题，可是免疫染色时，明
: 显的看到有一半的细胞没有荧光（也就是没有表达ＦＬＡＧ标签蛋白，也可以推断没有
: 表达我的目的膜蛋白）。
: 这样该怎么办啊？明显不是单克隆细胞系。
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j*****q
发帖数: 82 | 5 即使genetic information一致的两个细胞，也有可能有完全不同的phenotype的。
你这个如果确实是monoclonal cell line，那就sort那些还是fluorescent的细胞做实
验。
不过得问一句，你的单clone怎么挑的？
不过既然不在意genomic locus和copy number的，为什么要用单clone做实验呢？工作
量大，也说明不了很多问题啊，为什么不用pool的呢？ |
y***i
发帖数: 11639 | 6 稀释重调吧。挑细胞系不能省事，不然之后一堆麻烦。
【在 f********n 的大作中提到】
: 我原来制备过一次单克隆细胞系，就是同一个质粒转染挑了15个细胞系，然后RT——
: PCR，免疫染色来筛选出了一个表达很好的单克隆细胞系。
: 这次，因为一次要制备很多突变质粒(共8个左右）的单克隆细胞系，我实在是太累了，
: 累到郁闷死了。所以每一个突变质粒的转染，我就通过ＲＴ－ＰＣＲ选择后，冻存了２
: 个细胞系左右吧。
: 现在麻烦来了。
: 用ＧＥＮＥＴＩＣＩＮ没有死的细胞，ＲＴ——PCR也没有问题，可是免疫染色时，明
: 显的看到有一半的细胞没有荧光（也就是没有表达ＦＬＡＧ标签蛋白，也可以推断没有
: 表达我的目的膜蛋白）。
: 这样该怎么办啊？明显不是单克隆细胞系。
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p*f
发帖数: 77 | 7 It is really not recommended to use single clones for regular experiments.
LZ, do you have to use clones?
【在 j*****q 的大作中提到】
: 即使genetic information一致的两个细胞，也有可能有完全不同的phenotype的。
: 你这个如果确实是monoclonal cell line，那就sort那些还是fluorescent的细胞做实
: 验。
: 不过得问一句，你的单clone怎么挑的？
: 不过既然不在意genomic locus和copy number的，为什么要用单clone做实验呢？工作
: 量大，也说明不了很多问题啊，为什么不用pool的呢？
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f********n
发帖数: 6465 | 8 我当时就是太省事了。都是我不好。
我当时要制备8个突变体的单克隆细胞系。
每一种突变体都要挑选很多细胞系来筛选。
但是我是累到不行。就RT-PCR后，每个突变体就只保留了2个细胞系。
结果就发现，有的细胞根本就没有表达还活着呢。
不会让我又从头来一次吧。
还是在现有的基础上再挑呢?
【在 y***i 的大作中提到】
: 稀释重调吧。挑细胞系不能省事，不然之后一堆麻烦。
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f********n
发帖数: 6465 | 9 别人都是这么用的。我原来的野生型也是这么用的。
野生型时，我挑了15个细胞系，然后从中找到一个很好的细胞系，表达很不错呢。
这次要制备8个突变体，如果还是按原来的工作强度，要搞100多个细胞系慢慢挑。
我当时就偷了点懒（同一个突变体没有挑很多细胞系保存），结果，就出现了我标题的。
【在 p*f 的大作中提到】
: It is really not recommended to use single clones for regular experiments.
: LZ, do you have to use clones?
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j*****q
发帖数: 82 | 10 lz,如果是制备高表达的cell line，100多个真不算多，工业界都是几千几千的挑，不
过人家有technician，哈哈。 |
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f********n
发帖数: 6465 | 11 我原来野生型也是制备了快20个细胞系，然后挑出来了一个好的。
可是这次我要得到7个突变型的细胞系的话，工作量不是一般的大，是原来野生型的7倍。
所有工作从制备突变质粒到制备细胞系，都是我一个人做。。。。。。
【在 j*****q 的大作中提到】
: lz,如果是制备高表达的cell line，100多个真不算多，工业界都是几千几千的挑，不
: 过人家有technician，哈哈。
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f********n
发帖数: 6465 | |
h********n
发帖数: 4079 | 13 楼主, 你没有讲清楚整个实验的目的. 你能不能说说你为啥要在这么多细胞系里挑单克
隆呢?
总体上说, monoclonal (clonal) 和 polyclonal cell line用在实验中各有优缺点,
不能一概而论. 比如我过去的实验, 一般不用clonal cell line, 直接用FACS或者筛
选过的细胞(pool)来做实验.
如何选择取决于你的实验目的. |
f********n
发帖数: 6465 | 14 目的就是做后面的assay阿。选系然后做后面的assay.
【在 h********n 的大作中提到】
: 楼主, 你没有讲清楚整个实验的目的. 你能不能说说你为啥要在这么多细胞系里挑单克
: 隆呢?
: 总体上说, monoclonal (clonal) 和 polyclonal cell line用在实验中各有优缺点,
: 不能一概而论. 比如我过去的实验, 一般不用clonal cell line, 直接用FACS或者筛
: 选过的细胞(pool)来做实验.
: 如何选择取决于你的实验目的.
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h********n
发帖数: 4079 | 15 那为啥一定要clonal呢?
【在 f********n 的大作中提到】
: 目的就是做后面的assay阿。选系然后做后面的assay.
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f********n
发帖数: 6465 | 16 我也觉得单克隆不一定好。可是我老板不懂，他非要。
再加上最近的我们实验室，这几年都是单克隆。一致性？
【在 h********n 的大作中提到】
: 那为啥一定要clonal呢?
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