d**********9
发帖数: 981 | 1 本人有过几年的分子生物学的基础，原来作克隆的时候没有遇到过什么大问题，但都是
低于1Kb的PCR产物。但是最近换了一个实验室，一系列分子实验都严重受挫，我也不知
道是什么原因，实在没有招了，多谢高人指点
都是1500bp左右的PCR片断，我在设计引物的时候有在5‘端加了5个bp，PCR都一次能扩
出来，clean-up后酶切，之后再跑胶clean-up，跑了胶确定有条带，还挺亮的。于是跟
相同酶切，CIP处理后，跑胶clean-up的载体相连，室温过夜，也试过16度过夜，但是
transform到商品化的两种不同公司来的感受态细胞之后，都没有克隆出现，几个PCR产
物都是一样的问题
开始觉得可能是PCR产物没有酶切好，尝试先将PCR产物与T载体连接，transform之后也
没有克隆出现
是哪儿有问题，我该如何做？多谢！ |
b******y
发帖数: 627 | |
d**********9
发帖数: 981 | 3 肯定没有
【在 b******y 的大作中提到】
: wrong resistance?
|
X***n
发帖数: 366 | 4 try CPEC cloning or SLIC cloning. |
C**S
发帖数: 522 | 5 不需要跑胶纯化。
pcr产物---PCR purification---酶切---PCR purification
载体---CIP---PCR purification |
d**********9
发帖数: 981 | 6 这是什么？请求详解
【在 X***n 的大作中提到】
: try CPEC cloning or SLIC cloning.
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H*******i
发帖数: 196 | 7 你要别人帮你找问题，你不能写得这么笼统，具体的细节都要写出来
CPEC就是用PCR完成最后一步环化（引物长度的overlap），slic是用T4 DNA
polymerase切掉3'->5' 然后overlap部分互相结合环化，如果要高产率得话，可以
Gibson assembly。具体方法网上自己找好了，都不难。这三种方法引物也是一样的，
一个有问题可以试试另一种。 |
g*****n
发帖数: 250 | 8 1.跑胶clean-up会污染什么东西，抑制ligase. PCR products只好跑胶clean-up (
Qiagen kit). 载体就不必了.
2.酶切位点外要多出３-５个核苷，以确保酶切。
3.如果用的是Taq，酶切位点突变（可能性极小）。
TA也不成，看来２，３都不大可能是问题。但是，不妨考虑。
试试TA TOPO。然后再切下来装到你要的载体上。 |
z*********3
发帖数: 335 | 9 1. If RE works fine, check your ligase. Use high efficiency ligation kit
like NEBNext Quick Ligation Kit.
2. Change cloning strategy, e.g. PIPE cloning (NO RE, NO Ligase!!!)
http://pef.aibn.uq.edu.au/support/material/download/The_Polymer |
z*********3
发帖数: 335 | 10 TA does not work? Is the PCR product has blunt end? Do you use proofreading
polymerase?
If it is blunt end, follow protocol to Add 3′ A-Overhangs |
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H*********a
发帖数: 133 | 11 我曾遇到跟你类似的情况，也是新去一个实验室，也是从前的vector构建老手，但就是
怎么也转不出克隆来，找了无数原因。后来发现了一个极低级的，致命的错误。
我以前的实验室，LB板是技术员制备的，到了新实验后，LB板要自己制备，问题就出在
制备LB板上。
LB Agar应该直接溶解在water里，而我想当然地认为是agar，就溶解到LB溶液了。结果
就是，转化后怎么也不出克隆，24小时候能见到很小的克隆，挑出来摇菌都摇不起来。
你的原因也许不一定一样，但我的建议是，仔细检查一遍每个细节，哪怕最简单的细节
。 |
g***j
发帖数: 40861 | |
q***7
发帖数: 144 | 13 你的连接片段，PCR和载体可能混有洗液。洗液可以很大的影响抑制连接酶活性。你用
Nanodrop测片段浓度时，如果２６０／２３０比值很低，２３０有个大峰就说明洗液很
多。你可以试一下这个公司的gel extraction/PCR purification二合一KIT，所提取的
片段中没有洗液。可以提高连接和
克隆效率。
http://www.greenbioresearch.com/gel-extraction-pcr-purification |
x**e
发帖数: 163 | 14 是不是CIAP去磷酸化过头了。我在这边也有这种问题，CIAP似乎不太好用。 |
b******y
发帖数: 627 | 15 I never do CIP step. no problem so far after hundreds of constructs made. |
d**********9
发帖数: 981 | 16 多谢大家帮忙了，我在发帖之前自己也试过很多办法，但是都没有解决问题：
1.我试过在作1500bp片断连T载体的同时，作500bp片断的连接，没有问题，是不是
1500bp片断还是很难连很多？
2.本身我的酶切位点外多５个核苷，应该直接酶切没有问题
3.试过不同公司的ligase，但是transform之后都没有克隆
4。试过不同公司的感受态细胞，但是都没有克隆，对于单纯的质粒，能长克隆，可见
感受态细胞和LB板应该没有问题
5.没有试过不用CIP,接下来要试试
虽然所有的试剂都是到了新的实验室刚买的，但是也都是以前一直用着的。原来觉得实
验很简单，但是一直没有出东西，郁闷！ |
c********d
发帖数: 75 | 17 试试最后extra extension (68/72度C）时间长点，比如10分钟。我有个印象是DNA
polymerase到了template末端反应速度会慢下来，有时候会挂在上头不下来。这个在胶
上看不出来的。最后一个格外的extension时间帮助完成反应，得到一个完整DNA双链。
试试看。回来报告一下:) GOOD LUCK. |
b*********e
发帖数: 870 | 18 试试clonetech的infusion kit吧，只需要切plasmid，PCR产物不用切，直接做连接。
非常有效，从来没有失败过。这个的PCR引物需要特别设计，可以用他们的网上的
primer design tools来设计。 |
w********i
发帖数: 389 | |
f*********9
发帖数: 258 | 20 会有empty vector transform的细菌长出来吗
【在 d**********9 的大作中提到】
: 本人有过几年的分子生物学的基础，原来作克隆的时候没有遇到过什么大问题，但都是
: 低于1Kb的PCR产物。但是最近换了一个实验室，一系列分子实验都严重受挫，我也不知
: 道是什么原因，实在没有招了，多谢高人指点
: 都是1500bp左右的PCR片断，我在设计引物的时候有在5‘端加了5个bp，PCR都一次能扩
: 出来，clean-up后酶切，之后再跑胶clean-up，跑了胶确定有条带，还挺亮的。于是跟
: 相同酶切，CIP处理后，跑胶clean-up的载体相连，室温过夜，也试过16度过夜，但是
: transform到商品化的两种不同公司来的感受态细胞之后，都没有克隆出现，几个PCR产
: 物都是一样的问题
: 开始觉得可能是PCR产物没有酶切好，尝试先将PCR产物与T载体连接，transform之后也
: 没有克隆出现
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t*******o
发帖数: 516 | 21 你需要给出更多的details大家才好帮你。你用的是什么内切酶？你确定酶切一定没问
题？ |
q*******8
发帖数: 768 | 22
感受态的敏感性是不一样的，要检测感受态是否有功能，你要做的不只是阳性对照，还
要把你阳性对照里的质粒梯度稀释。
RESTRICTION ENZYME 也有讲究，NEB官网上对每个酶切位点都有评论，有的酶切位点就
是不好连。。。
另外TOPO TA真的很好用，超级快效率超级高，如果可以的话果断用TOPO的。
【在 d**********9 的大作中提到】
: 多谢大家帮忙了，我在发帖之前自己也试过很多办法，但是都没有解决问题：
: 1.我试过在作1500bp片断连T载体的同时，作500bp片断的连接，没有问题，是不是
: 1500bp片断还是很难连很多？
: 2.本身我的酶切位点外多５个核苷，应该直接酶切没有问题
: 3.试过不同公司的ligase，但是transform之后都没有克隆
: 4。试过不同公司的感受态细胞，但是都没有克隆，对于单纯的质粒，能长克隆，可见
: 感受态细胞和LB板应该没有问题
: 5.没有试过不用CIP,接下来要试试
: 虽然所有的试剂都是到了新的实验室刚买的，但是也都是以前一直用着的。原来觉得实
: 验很简单，但是一直没有出东西，郁闷！
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J*****a
发帖数: 22 | 23 强烈怀疑是片段酶切有问题。你用的什么酶？会不会有些酶需要比较多的保护碱基才能
切得动。
你也可以把你的连接体系拿去跑个电泳看看里面是什么情况。
建议把PCR片段先做TA克隆之后，再酶切回收片段做链接。 |
g*********9
发帖数: 3528 | 24 还有一些可能性就是你转的片段表达了什么有毒产物，或者是片段自己粘成一团复制不
出来。 |
H*******i
发帖数: 196 | 25 LZ你这么笼统的问，有问题的可能性多了去了，你应该详细写出你的步骤（包括片段
酶 载体 这些细节），现象
比如你上面提到转质粒能长，长了多少？ 效率是10^8还是10^9/ug
没有克隆是怎样没有，长出来很多都是假阳性/空载体还是什么都不长
这些你都不写谁知道啥问题啊，都只能猜，有多少步骤就能猜多少可能性出来。
另外1.5K很好连，尽管我不做TA克隆，不过3-5K的片段正常连接我也没遇到过什么大问题
你提到500做出来了，长了多少？阳性率怎么样？至少提一下吧。
要么你就用上面提到的不用酶切连接的几种策略，拿到引物后第二天晚上/第三天早晨
也足够拿到克隆了。你怕操作不熟练就用上面有人提到的infusion kit这种商业化试剂
盒也可以。这个理论上只要你的PCR没问题，转化没问题（包括你的片段载体构建不会
杀死细胞）就能做出来。 |
s*********u
发帖数: 2535 | 26 1. 1500bp片断应该问题不大，算中等长度的ligation，应该是可行的。
2. 五个应该够了，偶一般用的3到4个。
3. 这应该说明不是ligase的问题，很可能是insert和vector的问题。另外，注意
ligase buffer，用新的，这个容易降解。
4. good control。应该是ligation的问题。
5. 为什么要用CIP。质粒是用单一酶切的吗？如果是用的单一酶切的，可能必须使用
CIP防止自连。我们一般用两种不同酶切，这样可不用CIP处理。保证两个酶切完全的情
况下自身连接机率很小。以前用过一次CIP，效果很不好，也是不长克隆菌，有可能的
话建议避免使用。有研究表明CIP如果过度处理会部分甚至完全切掉sticky end。
另外，需要考虑一下，你这个克隆，是否对e.coli有toxic作用而使其不长或生长极缓
慢。
祝成功。
bless all!
【在 d**********9 的大作中提到】
: 多谢大家帮忙了，我在发帖之前自己也试过很多办法，但是都没有解决问题：
: 1.我试过在作1500bp片断连T载体的同时，作500bp片断的连接，没有问题，是不是
: 1500bp片断还是很难连很多？
: 2.本身我的酶切位点外多５个核苷，应该直接酶切没有问题
: 3.试过不同公司的ligase，但是transform之后都没有克隆
: 4。试过不同公司的感受态细胞，但是都没有克隆，对于单纯的质粒，能长克隆，可见
: 感受态细胞和LB板应该没有问题
: 5.没有试过不用CIP,接下来要试试
: 虽然所有的试剂都是到了新的实验室刚买的，但是也都是以前一直用着的。原来觉得实
: 验很简单，但是一直没有出东西，郁闷！
|
s******s
发帖数: 13035 | 27 没仔细看帖子。
是不是有人连接前CIP了？这玩意儿处理过就很难连了，除非
100%必要，否则宁愿多筛点克隆也不要用这个
【在 s*********u 的大作中提到】
: 1. 1500bp片断应该问题不大，算中等长度的ligation，应该是可行的。
: 2. 五个应该够了，偶一般用的3到4个。
: 3. 这应该说明不是ligase的问题，很可能是insert和vector的问题。另外，注意
: ligase buffer，用新的，这个容易降解。
: 4. good control。应该是ligation的问题。
: 5. 为什么要用CIP。质粒是用单一酶切的吗？如果是用的单一酶切的，可能必须使用
: CIP防止自连。我们一般用两种不同酶切，这样可不用CIP处理。保证两个酶切完全的情
: 况下自身连接机率很小。以前用过一次CIP，效果很不好，也是不长克隆菌，有可能的
: 话建议避免使用。有研究表明CIP如果过度处理会部分甚至完全切掉sticky end。
: 另外，需要考虑一下，你这个克隆，是否对e.coli有toxic作用而使其不长或生长极缓
|
H*******i
发帖数: 196 | 28 CIP没问题，我一般酶切+CIP 1h左右，假阳性率在切下的片段很短的情况下大大降低（
有些情况能降低90%以上）。
也能得到相当数量的克隆，一般总有接近100个。
当然LZ用CIP处理PCR片段我是不明白为什么，要解决的是载体中的假阳性，对片段处理
有啥用？
另外LZ说这么笼统，看起来你的实验步骤大体都是对的（反正至少你以前也做出来过不
是么。。），这样让其他人在这瞎猜一点意思都没。你尝试解决方法也只能瞎猜。 |
m****M
发帖数: 360 | 29 我怀疑是你最后片段里的洗液抑制了连接酶的活性。在要连接片段较大时尤其明显。有
个哥们给我推荐了一个公司的KIT，据说可以完全去掉洗液。我刚刚定了提质粒的和胶
回收的。比QIAGEN便宜多了，虽然我们学校可以拿到QIAGEN一定的折扣。还没有收到。
你也可以试一试。
http://www.greenbioresearch.com/gel-extraction-pcr-purification
【在 d**********9 的大作中提到】
: 多谢大家帮忙了，我在发帖之前自己也试过很多办法，但是都没有解决问题：
: 1.我试过在作1500bp片断连T载体的同时，作500bp片断的连接，没有问题，是不是
: 1500bp片断还是很难连很多？
: 2.本身我的酶切位点外多５个核苷，应该直接酶切没有问题
: 3.试过不同公司的ligase，但是transform之后都没有克隆
: 4。试过不同公司的感受态细胞，但是都没有克隆，对于单纯的质粒，能长克隆，可见
: 感受态细胞和LB板应该没有问题
: 5.没有试过不用CIP,接下来要试试
: 虽然所有的试剂都是到了新的实验室刚买的，但是也都是以前一直用着的。原来觉得实
: 验很简单，但是一直没有出东西，郁闷！
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c******r
发帖数: 3778 | 30 不可能用CIP处理PCR片段。lz说的是CIP处理过的载体。
【在 H*******i 的大作中提到】
: CIP没问题，我一般酶切+CIP 1h左右，假阳性率在切下的片段很短的情况下大大降低（
: 有些情况能降低90%以上）。
: 也能得到相当数量的克隆，一般总有接近100个。
: 当然LZ用CIP处理PCR片段我是不明白为什么，要解决的是载体中的假阳性，对片段处理
: 有啥用？
: 另外LZ说这么笼统，看起来你的实验步骤大体都是对的（反正至少你以前也做出来过不
: 是么。。），这样让其他人在这瞎猜一点意思都没。你尝试解决方法也只能瞎猜。
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H*******i
发帖数: 196 | |
h**********r
发帖数: 671 | 32 这个价格看着真好啊！不知道效果怎么样？QIAGEN的也不错，就是太贵了。我都想订了
。200以上免shipping fee。Zymo的怎么样？
【在 m****M 的大作中提到】
: 我怀疑是你最后片段里的洗液抑制了连接酶的活性。在要连接片段较大时尤其明显。有
: 个哥们给我推荐了一个公司的KIT，据说可以完全去掉洗液。我刚刚定了提质粒的和胶
: 回收的。比QIAGEN便宜多了，虽然我们学校可以拿到QIAGEN一定的折扣。还没有收到。
: 你也可以试一试。
: http://www.greenbioresearch.com/gel-extraction-pcr-purification
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H*******i
发帖数: 196 | 33 zymo买那个可以6ul洗脱的kit就可以了，大得我感觉没啥优势。 |
b*******H
发帖数: 830 | 34 有一种可能性不能排除：我们实验室遇到过同样现象。
我们号称做克隆最牛，每一次都是教科书级的水平。但有一次一个学生克隆一个怎么也
做不出来，实验员上来也还不行。最后一次偶然机会，用了BL21-plys做感受态细胞，
做出来了。结果发现此蛋白对细菌剧毒，痕量的leaking expression足以杀死细胞。此
结果发在了G&D上了。
还有一种可能： 仔细检查你的引物，很可能有设计失误，一个碱基的错误就会出您这
样的结果，您懂的。如果没有设计错误，重合引物是最佳选择。
GOOD LUCK! |
b*******H
发帖数: 830 | 35 另外一个建议：
NEB的QUICK LIGASE效果奇佳，室温10分钟搞定，本人已用它搞定了上千个CONSTRUCT了
，无一失手。很不明白那么多人还在继续用老的LIGASE。我们的政策是，每天九点上班
来做PCR，下午五点下班前搞定转化，第二天就要拿板子来看结果。 |
W*V
发帖数: 13 | 36 我周一作了四个TRIP-LIGATION 克隆, 筛选都阳性. 今天又作了六个. 集我30年的分
子生物学的工作经验, 我有一套简易,有效的基因克隆方法. 无论片断大小 (>8Kb),
无论酶切类型, 无论何种载体 和感受态细胞, 全都工作,没有问题. 可惜因为版权
关系 (正在写书),其操作步骤现只能非免费提供. 该克隆方法(章节) 转让费为$100.
为证明其可信度,我可以为你作一免费克隆. 你只提供目标片断, 我在三天内交付你
克隆好的质粒. 有兴趣的话,可联系,用此邮箱. |
W*V
发帖数: 13 | 37 我周一作了四个TRIP-LIGATION 克隆, 筛选都阳性. 今天又作了六个. 集30年的分子生
物学的工作经验, 我有一套简易,有效的基因克隆方法. 无论片断大小 (>8Kb), 无论酶
切类型, 无论何种载体 和感受态细胞, 全都工作,没有问题. 可惜因为版权关系 (正在
写书),其操作步骤现只能非免费提供. 该克隆方法(章节) 转让费为$100.为证明其可信
度,我可以为你作一免费克隆. 你只提供目标片断, 我在三天内交付你克隆好的质粒.
有兴趣的话,可联系,用此邮箱. l******[email protected] |
