b******e
发帖数: 61 | 1 最近被一个cloning给弄得焦头烂额的。我的目的是想把一个4kb的片断从pcDNA3弄出来
，然后克隆到pLenti7.3里边去。我试了两种strategies:
1, 先把4kb的片断从pcDNA3用RE切出来，然后用klenow补平，再用Taq加上3’A。然后
用TOPO TA cloning到pLenti7.3。结果：一个克隆都没有长
2, 用PCR直接把4kb的片断从pcDNA3里amplify出来 (用invitrogen pfx DNA
polymerase)，然后用Taq加上3’A，再用TOPO TA cloning到pLenti7.3。结果：长了一
个克隆，假阳性的。
想请教各位大牛，有没有什么建议对于大片段的TA连接。万分感谢！！！ |
r*****m
发帖数: 231 | |
b******e
发帖数: 61 | 3 多谢楼上的回复。
因为我的目的是想把4kb片断弄到pLenti7.3里边去，没有合适的酶切位点，只好用TA
cloning. 我也试过不用kit里边带的topo, 自己用T4 Ligase做TA连接，也失败了。
【在 b******e 的大作中提到】
: 最近被一个cloning给弄得焦头烂额的。我的目的是想把一个4kb的片断从pcDNA3弄出来
: ，然后克隆到pLenti7.3里边去。我试了两种strategies:
: 1, 先把4kb的片断从pcDNA3用RE切出来，然后用klenow补平，再用Taq加上3’A。然后
: 用TOPO TA cloning到pLenti7.3。结果：一个克隆都没有长
: 2, 用PCR直接把4kb的片断从pcDNA3里amplify出来 (用invitrogen pfx DNA
: polymerase)，然后用Taq加上3’A，再用TOPO TA cloning到pLenti7.3。结果：长了一
: 个克隆，假阳性的。
: 想请教各位大牛，有没有什么建议对于大片段的TA连接。万分感谢！！！
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h***e
发帖数: 146 | |
r*****m
发帖数: 231 | 5 把需要的位点设计在PCR引物的两端，PCR后用酶切然后连上vector。你的Lenti vector
应该至少有7，8kb吧，连个4kb的一般不会出问题。一般人做PCR cloning都是这么做的
，做不出来的才用TOPO。但你是TOPO都做不出来，就不知道为什么了。。。检查下你的
Taq是不是有问题吧。。。 |
i*********t
发帖数: 78 | 6 用Invitrogen Gateway system: pLenti7.3⁄V5-DEST™ Gateway®
Vector Kit, 4kb 插入对pLenti7.3/V5 Topo 太大了。 |
