v***a
发帖数: 1242 | 1 前几次一直长不出colony，换了一个ligase，这次transformation后平板上长得满满趴
趴。同时也用了一个uncut的vector做+ve ctrl，长得比有insert的还要满。
很高兴。挑了18个colony做PCR check，结果出来傻眼了，什么都没有，光marker那一
条lane亮的。大家觉得这是怎么回事啊？多谢多谢！ |
m**z
发帖数: 787 | 2 how about your negative control?
【在 v***a 的大作中提到】
: 前几次一直长不出colony，换了一个ligase，这次transformation后平板上长得满满趴
: 趴。同时也用了一个uncut的vector做+ve ctrl，长得比有insert的还要满。
: 很高兴。挑了18个colony做PCR check，结果出来傻眼了，什么都没有，光marker那一
: 条lane亮的。大家觉得这是怎么回事啊？多谢多谢！
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v***a
发帖数: 1242 | 3 前几次没有长出colony，所以没有设-ve ctrl。。。
【在 m**z 的大作中提到】
: how about your negative control?
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m**z
发帖数: 787 | 4 我总觉得ligation plate上面长得太满不见得是好事。。。
【在 v***a 的大作中提到】
: 前几次没有长出colony，所以没有设-ve ctrl。。。
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v***a
发帖数: 1242 | 5 是啊，满得不得了，感觉就是成千上万个
都试了2个月了，一直clone不出来
【在 m**z 的大作中提到】
: 我总觉得ligation plate上面长得太满不见得是好事。。。
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n***w
发帖数: 2405 | 6 试试用restriction enzyme来check你有没有插入目的片断。
找一个vector上和你目的片断里都有的一个酶，然后切看看。
有可能你载体自连了。试试dephosphorylation. |
T**********t
发帖数: 1604 | 7 不做negative control，就很难troubleshoot啊。再做一次吧，做实验经常是这样，做
十次control都没问题，一次偷懒不做就出问题了。所以还是不要怕麻烦，尽量把该做
的control都做上。
【在 v***a 的大作中提到】
: 前几次没有长出colony，所以没有设-ve ctrl。。。
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v***a
发帖数: 1242 | 8 谢谢！
【在 n***w 的大作中提到】
: 试试用restriction enzyme来check你有没有插入目的片断。
: 找一个vector上和你目的片断里都有的一个酶，然后切看看。
: 有可能你载体自连了。试试dephosphorylation.
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v***a
发帖数: 1242 | 9 多谢了！刚才查了一下，说colony长得异乎寻常的多有可能是RE incompletely cut。
想了想，可能是我的enzyme的缘故，我用的其中之一是SalI，网上有人提到这个enzyme
has problem with PCR product，所以打算重新设计primer。谢谢大家的帮助，也希
望托大家的福这次可以成功。
【在 T**********t 的大作中提到】
: 不做negative control，就很难troubleshoot啊。再做一次吧，做实验经常是这样，做
: 十次control都没问题，一次偷懒不做就出问题了。所以还是不要怕麻烦，尽量把该做
: 的control都做上。
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c***r
发帖数: 1132 | 10 有没有positive control啊？有的话也一起做吧，尤其是没结果的时候。
【在 v***a 的大作中提到】
: 前几次没有长出colony，所以没有设-ve ctrl。。。
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p******i
发帖数: 1092 | 11 很WS地問，會不會是抗生素壞了……
【在 v***a 的大作中提到】
: 前几次一直长不出colony，换了一个ligase，这次transformation后平板上长得满满趴
: 趴。同时也用了一个uncut的vector做+ve ctrl，长得比有insert的还要满。
: 很高兴。挑了18个colony做PCR check，结果出来傻眼了，什么都没有，光marker那一
: 条lane亮的。大家觉得这是怎么回事啊？多谢多谢！
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i*****i
发帖数: 30 | 12 首先问楼主
1.PCR出来有条带吗
2.是双酶切吗，单salI必须去磷酸化，引物有保护碱基吗 |
v***a
发帖数: 1242 | 13 PCR check看不到任何条带
是双酶切，用的另一个是MluI，引物前都各加了2个保护碱基
期待高见
【在 i*****i 的大作中提到】
: 首先问楼主
: 1.PCR出来有条带吗
: 2.是双酶切吗，单salI必须去磷酸化，引物有保护碱基吗
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C*******e
发帖数: 4348 | 14 2 个碱基保护未必够
我记得有个表格是说常用限制性内切酶分别需要几个碱基保护、酶切效率是多少
表格不在手边
不过你可以网上搜一下
另外也有可能像我上次遇到的，引物5'端合成的时候就少了
但是看你的描述我觉得更有可能的就是ligation不work
因为某些原因平板张长的都是false positive
ligation之后长满满的一般真不是好事
【在 v***a 的大作中提到】
: PCR check看不到任何条带
: 是双酶切，用的另一个是MluI，引物前都各加了2个保护碱基
: 期待高见
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v***a
发帖数: 1242 | 15 谢谢！那个表格我查到了。有一个问题啊，每个酶具体用什么保护碱基有章可循吗？比
如单是数量满足就行，还是碱基数量和种类要一样？
你说的ligation的问题我也觉得，那可能根子还在RE上。我再试试。多谢多谢！
【在 C*******e 的大作中提到】
: 2 个碱基保护未必够
: 我记得有个表格是说常用限制性内切酶分别需要几个碱基保护、酶切效率是多少
: 表格不在手边
: 不过你可以网上搜一下
: 另外也有可能像我上次遇到的，引物5'端合成的时候就少了
: 但是看你的描述我觉得更有可能的就是ligation不work
: 因为某些原因平板张长的都是false positive
: ligation之后长满满的一般真不是好事
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C*******e
发帖数: 4348 | 16 碱基保护在数量上
具体什么碱基应该是没有关系的
因为所谓“限制性酶切位点”就已经决定了除开这个识别位点以外、
上游或者下游的序列跟酶切无关
加几个碱基作为“保护”还是可以从名称上想明白为什么
“限制性内切酶”
所谓“内切”
而不是在末端切
就决定了当我们人为的把酶切位点设计在引物末端的时候需要再
加几个碱基以保证可以切得动
除非你不是直接切PCR产物
而是用TA cloning或者TOPO-Blunt end cloning先把PCR产
物放到TA/TOPO vector里面了
【在 v***a 的大作中提到】
: 谢谢！那个表格我查到了。有一个问题啊，每个酶具体用什么保护碱基有章可循吗？比
: 如单是数量满足就行，还是碱基数量和种类要一样？
: 你说的ligation的问题我也觉得，那可能根子还在RE上。我再试试。多谢多谢！
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v***a
发帖数: 1242 | 17 谢谢谢谢！！！解释得真清楚！
【在 C*******e 的大作中提到】
: 碱基保护在数量上
: 具体什么碱基应该是没有关系的
: 因为所谓“限制性酶切位点”就已经决定了除开这个识别位点以外、
: 上游或者下游的序列跟酶切无关
: 加几个碱基作为“保护”还是可以从名称上想明白为什么
: “限制性内切酶”
: 所谓“内切”
: 而不是在末端切
: 就决定了当我们人为的把酶切位点设计在引物末端的时候需要再
: 加几个碱基以保证可以切得动
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