s********8
发帖数: 619 | 1 现在PCR了一个8k的片段,要blunt end克隆到pBluescript里去(ECoRV digested),应该
用什么ratio呢?大家都说应该3:1或更多,但是我的载体才3k,insert 8k的话,到底那个
算insert,那个算vector 呢?理论上难道不是1:1最好连吗?
先前做了一个5k的blunt end clone,用的是3:1ratio,似乎没连出来.克隆倒是长了一些
,不过貌似没有insert.(我做了colony PCR).
请克隆牛人赐教! |
z*******o
发帖数: 1794 | 2 小片段往大载体连，用3：1甚至更多。
大片段往小载体连，反之。
你这种情况效率会比较低，最好别用blunt end，如果能够找到合适的enzyme，两个粘
末端的酶会好一些。 |
n***w
发帖数: 2405 | |
s******s
发帖数: 13035 | 4 我都随便混混，这种PCR浓度高的一般总是能连出来的。
你假阳性太多，可以考虑CIP/SAP处理一下vector， PCR加个5p？
【在 s********8 的大作中提到】
: 现在PCR了一个8k的片段,要blunt end克隆到pBluescript里去(ECoRV digested),应该
: 用什么ratio呢?大家都说应该3:1或更多,但是我的载体才3k,insert 8k的话,到底那个
: 算insert,那个算vector 呢?理论上难道不是1:1最好连吗?
: 先前做了一个5k的blunt end clone,用的是3:1ratio,似乎没连出来.克隆倒是长了一些
: ,不过貌似没有insert.(我做了colony PCR).
: 请克隆牛人赐教!
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s********8
发帖数: 619 | 5 vector是用SAP处理过了的,对照板上也长了些, 似乎没有弄干净.我换个ratio试试吧.
再不行就重新订引物加酶切吧.看来blunt end没那么好做呀!
【在 s******s 的大作中提到】
: 我都随便混混，这种PCR浓度高的一般总是能连出来的。
: 你假阳性太多，可以考虑CIP/SAP处理一下vector， PCR加个5p？
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s********8
发帖数: 619 | 6 有道理,刚才看了看sequence,可以用的酶挺多的,还是加酶切位点吧.一开始没加是因为
想做TA克隆来着,结果没做出来,一查发现TA克隆大片段效率也是比较低的.唉唉,从一开
始就打错了算盘,还是没经验呀!
【在 z*******o 的大作中提到】
: 小片段往大载体连，用3：1甚至更多。
: 大片段往小载体连，反之。
: 你这种情况效率会比较低，最好别用blunt end，如果能够找到合适的enzyme，两个粘
: 末端的酶会好一些。
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s********8
发帖数: 619 | 7 PCR加个5p?从没听说过这个,怎么操作?
【在 s******s 的大作中提到】
: 我都随便混混，这种PCR浓度高的一般总是能连出来的。
: 你假阳性太多，可以考虑CIP/SAP处理一下vector， PCR加个5p？
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s*******q
发帖数: 81 | 8 我一般都用4:1或6:1
除了vector SAP 去磷酸化，还可以对insert磷酸化以增强效率
【在 s********8 的大作中提到】
: 现在PCR了一个8k的片段,要blunt end克隆到pBluescript里去(ECoRV digested),应该
: 用什么ratio呢?大家都说应该3:1或更多,但是我的载体才3k,insert 8k的话,到底那个
: 算insert,那个算vector 呢?理论上难道不是1:1最好连吗?
: 先前做了一个5k的blunt end clone,用的是3:1ratio,似乎没连出来.克隆倒是长了一些
: ,不过貌似没有insert.(我做了colony PCR).
: 请克隆牛人赐教!
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s******y
发帖数: 28562 | 9 对于vector 和 insert的理解不是按大小而定的。
其实因为抗生素（或者其他什么用来做选择的）基因以及各种乱七八糟用
来扩展的因子等等都是在vector上的，所以没有连上vector的片断都不能
在细菌里面扩增。
所以包含抗生素和那些扩展因子的都是vector，再小也是。
不包含这些的就是insert, 再大也是
【在 s********8 的大作中提到】
: 现在PCR了一个8k的片段,要blunt end克隆到pBluescript里去(ECoRV digested),应该
: 用什么ratio呢?大家都说应该3:1或更多,但是我的载体才3k,insert 8k的话,到底那个
: 算insert,那个算vector 呢?理论上难道不是1:1最好连吗?
: 先前做了一个5k的blunt end clone,用的是3:1ratio,似乎没连出来.克隆倒是长了一些
: ,不过貌似没有insert.(我做了colony PCR).
: 请克隆牛人赐教!
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s********8
发帖数: 619 | 10 多谢艳阳天mm指点,那么我还是应该多加PCR产物喽?怎么跟二楼的同学说的相反呢?到底
那个操作是正确滴?
【在 s******y 的大作中提到】
: 对于vector 和 insert的理解不是按大小而定的。
: 其实因为抗生素（或者其他什么用来做选择的）基因以及各种乱七八糟用
: 来扩展的因子等等都是在vector上的，所以没有连上vector的片断都不能
: 在细菌里面扩增。
: 所以包含抗生素和那些扩展因子的都是vector，再小也是。
: 不包含这些的就是insert, 再大也是
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c***3
发帖数: 527 | 11 PCR 片段有加 Pi 吗 （T4PNK 处理）？假如 CIP vector （通常是必须的，否则效率
太太低）。 |
s********8
发帖数: 619 | 12 刚刚意识到我应该磷酸化PCR产物.从没做过blunt end克隆的我真有够土啊!
哪位好心的同学给个简单的protocol?
【在 c***3 的大作中提到】
: PCR 片段有加 Pi 吗 （T4PNK 处理）？假如 CIP vector （通常是必须的，否则效率
: 太太低）。
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h**********r
发帖数: 671 | 13 用NEB的Quick Blunting Kit，把PCR产物处理一下就OK了。里面有磷酸化的功能。
载体去一下磷酸化，应该就O了。
Purchase the Quick Blunting Kit with the Quick Ligation Kit and save 15%.
目前NEB还有点小折扣。我用过，还行。 |
z*******o
发帖数: 1794 | 14 貌似不矛盾吧。我没有说小片段就是insert，大片段就是vector阿。是否生长取决于带
有抗性基因的vector片段能否环化，而能否环化的关键是vector和insert能否连上。我
的理解是，在连接的这个阶段，只是碱基的连接，和vector上面的东西关系不大，那些
东西是用来扩增的。如果只考虑连接的话，你觉得vector和insert有什么区别么？无非
就是两个线性DNA进行环化而已。粘末端的连接效率显然比平端的效率高，所以建议楼
主试double digest。
【在 s********8 的大作中提到】
: 多谢艳阳天mm指点,那么我还是应该多加PCR产物喽?怎么跟二楼的同学说的相反呢?到底
: 那个操作是正确滴?
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s********8
发帖数: 619 | 15 多谢大家指点,现在试试T4PNK,做不出来的话就换引物加酶切位点.我会回来update的. |
s******s
发帖数: 13035 | 16 PNK或者直接合成带5p的引物？
【在 s********8 的大作中提到】
: PCR加个5p?从没听说过这个,怎么操作?
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s******y
发帖数: 28562 | 17 在我的理解中，多加PCR产物肯定是不会错的，因为多加了PCR产物，坏处最多就是
他们自己连接起来，但是反正他们不能在细菌里面扩增，奈何不了你。
但是多加了vector, 就会增加vector 自己链接的风险，增加产物的伪阳性比例
另外一点大家说得非常对，就是必须把insert磷酸化， vector去磷酸化
【在 s********8 的大作中提到】
: 多谢艳阳天mm指点,那么我还是应该多加PCR产物喽?怎么跟二楼的同学说的相反呢?到底
: 那个操作是正确滴?
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z*******o
发帖数: 1794 | 18 在单酶切，并且是vector不去磷酸化的情况下，多加PCR产物肯定没有问题。但这样的
条件谁也不会去做连接，vector自连的风险太高了，就算运气好进去了还有一个正反的
问题。如果是两个酶totally digested呢？原则上说vector将不会存在自我连接的风险
，同时这样的连接无论vector还是insert都是定向的高效连接。
【在 s******y 的大作中提到】
: 在我的理解中，多加PCR产物肯定是不会错的，因为多加了PCR产物，坏处最多就是
: 他们自己连接起来，但是反正他们不能在细菌里面扩增，奈何不了你。
: 但是多加了vector, 就会增加vector 自己链接的风险，增加产物的伪阳性比例
: 另外一点大家说得非常对，就是必须把insert磷酸化， vector去磷酸化
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A*******e
发帖数: 284 | 19 我也一直觉得自己没有真正搞清楚这个连接比例的问题，正常的情况下比较好做克隆也
就不顾这些了，但碰到一些极端情况，如极大或极小的insert，就觉得难了。假若我不
告诉你那个是载体，那个是片段，告诉你需要将两个DNA分子连接起来，该取什么样的
摩尔比。
单梅切若载体不去磷酸化，基本没有成功的可能。最好双酶切的策略。这种8kb的片段
比较大，很难克隆的。 另外我觉得产物纯度很重要，尤其是胶回收的产物，每次测得
时候总发现260/230的比例不够理想，所以觉得这种回收产物最好不要加太多到连接体
系里面。实际上我也发现胶回收的片段加多了就会连接不好 |
s******y
发帖数: 28562 | 20 但是反正多加insert 是肯定不会出问题的：）因为反正他们就算自己链上了
也奈何不了你
所以为了保险以见，这个insert, 多多益善
【在 z*******o 的大作中提到】
: 在单酶切，并且是vector不去磷酸化的情况下，多加PCR产物肯定没有问题。但这样的
: 条件谁也不会去做连接，vector自连的风险太高了，就算运气好进去了还有一个正反的
: 问题。如果是两个酶totally digested呢？原则上说vector将不会存在自我连接的风险
: ，同时这样的连接无论vector还是insert都是定向的高效连接。
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z*t
发帖数: 863 | 21 单酶切条件下insert磷酸化+vector去磷酸化能把自连降到多少？
现在想把一个cDNA subclone into another vector,但目的vector只有两个酶BamHI和
MluI可以切，并且BamHI还会在cDNA内部有一个切点。。。除了单酶切，我还有什么办
法么？
【在 z*******o 的大作中提到】
: 在单酶切，并且是vector不去磷酸化的情况下，多加PCR产物肯定没有问题。但这样的
: 条件谁也不会去做连接，vector自连的风险太高了，就算运气好进去了还有一个正反的
: 问题。如果是两个酶totally digested呢？原则上说vector将不会存在自我连接的风险
: ，同时这样的连接无论vector还是insert都是定向的高效连接。
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n***w
发帖数: 2405 | 22 也不一定必须磷酸化吧。。。
【在 s******y 的大作中提到】
: 在我的理解中，多加PCR产物肯定是不会错的，因为多加了PCR产物，坏处最多就是
: 他们自己连接起来，但是反正他们不能在细菌里面扩增，奈何不了你。
: 但是多加了vector, 就会增加vector 自己链接的风险，增加产物的伪阳性比例
: 另外一点大家说得非常对，就是必须把insert磷酸化， vector去磷酸化
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b******n
发帖数: 4225 | 23 呵呵，那可以这样，先BamHI单酶切连接PCR产物的一部分
（外面的BamHI位点设计成BglII）
然后再MluI和BamHI双酶切连接PCR产物的另外一部分
PCR产物 MluI-BamHI-BglII
先克隆BamHI-BglII片段进入BamHI消化的载体
得到正确克隆之后再克隆MluI-BamHI进去
这个缺点就是没法转移到另外一个载体上去了
【在 z*t 的大作中提到】
: 单酶切条件下insert磷酸化+vector去磷酸化能把自连降到多少？
: 现在想把一个cDNA subclone into another vector,但目的vector只有两个酶BamHI和
: MluI可以切，并且BamHI还会在cDNA内部有一个切点。。。除了单酶切，我还有什么办
: 法么？
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C*******e
发帖数: 4348 | 24 个人觉得TA clone不咋好用
TOPO blunt end很好用，注意要买II，不是I，I还是要用ligase的
TOPO blunt end II就是PCR产物直接跟vector室温混半小时
然后transfer
【在 s********8 的大作中提到】
: 现在PCR了一个8k的片段,要blunt end克隆到pBluescript里去(ECoRV digested),应该
: 用什么ratio呢?大家都说应该3:1或更多,但是我的载体才3k,insert 8k的话,到底那个
: 算insert,那个算vector 呢?理论上难道不是1:1最好连吗?
: 先前做了一个5k的blunt end clone,用的是3:1ratio,似乎没连出来.克隆倒是长了一些
: ,不过貌似没有insert.(我做了colony PCR).
: 请克隆牛人赐教!
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C*******e
发帖数: 4348 | 25 +1
我做过无数克隆了
从200bp的到12kb的insert
最近还做比较crazy的vector加4个insert片段一起ligate
从来都是vector:insert是insert过量
不管Insert长短
【在 s******y 的大作中提到】
: 但是反正多加insert 是肯定不会出问题的：）因为反正他们就算自己链上了
: 也奈何不了你
: 所以为了保险以见，这个insert, 多多益善
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s********8
发帖数: 619 | 26 我的回收产物应该还是比较好的,260/230挺高,应该没有什么salt contamination.现在
已经pnk treat了纯化的PCR产物, 试一下3:1 blunt end 连接.如果不成功的话我就重
新订引物双酶切了.下次还是尽量不要做blunt end 克隆了.
【在 A*******e 的大作中提到】
: 我也一直觉得自己没有真正搞清楚这个连接比例的问题，正常的情况下比较好做克隆也
: 就不顾这些了，但碰到一些极端情况，如极大或极小的insert，就觉得难了。假若我不
: 告诉你那个是载体，那个是片段，告诉你需要将两个DNA分子连接起来，该取什么样的
: 摩尔比。
: 单梅切若载体不去磷酸化，基本没有成功的可能。最好双酶切的策略。这种8kb的片段
: 比较大，很难克隆的。 另外我觉得产物纯度很重要，尤其是胶回收的产物，每次测得
: 时候总发现260/230的比例不够理想，所以觉得这种回收产物最好不要加太多到连接体
: 系里面。实际上我也发现胶回收的片段加多了就会连接不好
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s********8
发帖数: 619 | 27 vector去磷酸的话,insert就必须要磷酸化了, 如果是PCR产物的话.这个我也是才搞明
白滴.
【在 n***w 的大作中提到】
: 也不一定必须磷酸化吧。。。
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s********8
发帖数: 619 | 28 头一次听说topo blunt end呀.这个你最大连过多大的片段?
【在 C*******e 的大作中提到】
: 个人觉得TA clone不咋好用
: TOPO blunt end很好用，注意要买II，不是I，I还是要用ligase的
: TOPO blunt end II就是PCR产物直接跟vector室温混半小时
: 然后transfer
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h**********r
发帖数: 671 | 29 在此拜过克隆达人，跪求葵花宝典。
我正好有个克隆要做，就是teminator-promoter-ORF-terminator.
一看酶切位点设计的正好是：
pUC19 (HindIII)-(HindIII)terminator(PstI)- (PstI)promoter (XbaI)- (XbaI)ORF(
KpnI)-(KpnI)terminator(EcoRI)- pUC19 (EcoRI)
片段都不大。
请问葡萄MM，我这个能crazy一把吗？我做克隆也是身经百战了。
直接切PCR产物就OK了吧？
多谢！
实验成功，必有包子酬谢！
【在 C*******e 的大作中提到】
: +1
: 我做过无数克隆了
: 从200bp的到12kb的insert
: 最近还做比较crazy的vector加4个insert片段一起ligate
: 从来都是vector:insert是insert过量
: 不管Insert长短
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h**********r
发帖数: 671 | 30 以前就想到那个yeast homologous recombination了······ |
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C*******e
发帖数: 4348 | 31 11-12 kb
不过这么大的我是PCR纯化过的
一般的只要跑胶是一条带，不用纯化直接用
还用这个做过3‘race的最后一步
（就是说不是一条带，是一个混合物）
【在 s********8 的大作中提到】
: 头一次听说topo blunt end呀.这个你最大连过多大的片段?
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C*******e
发帖数: 4348 | 32 hoho，我这两天做的也是基于pUC19的
是pUC19(SacI)-(SacI)fragment I(XmaI)-(XmaI)fragment II(BamHI)-(BamHI)
fragment III(XbaI)-(XbaI)fragmentIV(HindIII)-pUC19(HindIII)
每个fragment大概0.8-1.1kb
然后我做的是pUC19 50 ng,
pUC19:f1:f2:f3:f4=1:5:5:5
总体积15-20 ul
ligate 20 hrs
然后3 ul加到一管TOP10电感化态细胞里
涂100-200 ul/平板
然后挑克隆
用colony digestion筛选
一起做了五个ligation
一天筛了近90个克隆
每个ligation都筛出正确的了
然后这些positive的提质粒出来
用不同的酶切再确认一下
然后测个序（或者不测）
直接PCR的切就行
不过我个人比较喜欢的是每个片段先做到TOPO里面（pBluntII)
先测序
挑序列正确的再酶切、胶纯化，往下做
这样每一步都是正确的序列
最后终产物酶切什么都对的话不测序也没关系
不然如果终产物很大，前面每一步都没有测过序
很有可能杯具
不过这只是我的个人习惯
ORF(
【在 h**********r 的大作中提到】
: 在此拜过克隆达人，跪求葵花宝典。
: 我正好有个克隆要做，就是teminator-promoter-ORF-terminator.
: 一看酶切位点设计的正好是：
: pUC19 (HindIII)-(HindIII)terminator(PstI)- (PstI)promoter (XbaI)- (XbaI)ORF(
: KpnI)-(KpnI)terminator(EcoRI)- pUC19 (EcoRI)
: 片段都不大。
: 请问葡萄MM，我这个能crazy一把吗？我做克隆也是身经百战了。
: 直接切PCR产物就OK了吧？
: 多谢！
: 实验成功，必有包子酬谢！
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h**********r
发帖数: 671 | 33 谢谢菩提！
我马上开干了，图已经画好打印放在桌子上了。
我只有自制的top10.
【在 C*******e 的大作中提到】
: hoho，我这两天做的也是基于pUC19的
: 是pUC19(SacI)-(SacI)fragment I(XmaI)-(XmaI)fragment II(BamHI)-(BamHI)
: fragment III(XbaI)-(XbaI)fragmentIV(HindIII)-pUC19(HindIII)
: 每个fragment大概0.8-1.1kb
: 然后我做的是pUC19 50 ng,
: pUC19:f1:f2:f3:f4=1:5:5:5
: 总体积15-20 ul
: ligate 20 hrs
: 然后3 ul加到一管TOP10电感化态细胞里
: 涂100-200 ul/平板
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C*******e
发帖数: 4348 | 34 自制还是买无所谓
用电转化就行
效率高点
【在 h**********r 的大作中提到】
: 谢谢菩提！
: 我马上开干了，图已经画好打印放在桌子上了。
: 我只有自制的top10.
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n***w
发帖数: 2405 | 35
如果insert是sticky ends呢。
【在 s********8 的大作中提到】
: vector去磷酸的话,insert就必须要磷酸化了, 如果是PCR产物的话.这个我也是才搞明
: 白滴.
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n***w
发帖数: 2405 | 36 +1
好厉害
【在 C*******e 的大作中提到】
: hoho，我这两天做的也是基于pUC19的
: 是pUC19(SacI)-(SacI)fragment I(XmaI)-(XmaI)fragment II(BamHI)-(BamHI)
: fragment III(XbaI)-(XbaI)fragmentIV(HindIII)-pUC19(HindIII)
: 每个fragment大概0.8-1.1kb
: 然后我做的是pUC19 50 ng,
: pUC19:f1:f2:f3:f4=1:5:5:5
: 总体积15-20 ul
: ligate 20 hrs
: 然后3 ul加到一管TOP10电感化态细胞里
: 涂100-200 ul/平板
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C*******e
发帖数: 4348 | 37 去磷酸化的vector加sticky ends的insert没问题
其实去不去磷酸化什么的都无所谓
我大多数情况下都不去
如果ligation的时候出问题多半不是去不去磷酸化什么的
多半是片段重新准备啊，浓一点，干净一点
多试几个ratio
vector多放点
就差不多了
vector去磷酸化不过是让自己放心
trouble shooting的时候可以排除掉一个vector自连而已
【在 n***w 的大作中提到】
: +1
: 好厉害
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h**********r
发帖数: 671 | 38 菩提MM,开个公司吧，给版友干点儿私活儿也行。建议业务如下：
1. 只做四个片段以上的链接（注：不含载体）；
2. 只做15kb以上的PCR及克隆；
3. 专治各种克隆不适；
4. 欢迎补充。
谢谢！ |
C*******e
发帖数: 4348 | 39 倒是想开公司
不过开你说的这种公司太吃力不讨好了：）
哦，两年前好像有人在这里贴广告要找人做克隆的
一个克隆才出价100刀，还要10天内出货
我想了一下觉得实在不划算
【在 h**********r 的大作中提到】
: 菩提MM,开个公司吧，给版友干点儿私活儿也行。建议业务如下：
: 1. 只做四个片段以上的链接（注：不含载体）；
: 2. 只做15kb以上的PCR及克隆；
: 3. 专治各种克隆不适；
: 4. 欢迎补充。
: 谢谢！
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j****x
发帖数: 1704 | 40 hehe，没错，太不划算了
genescript这样的苦力公司，一个最最简单的subcloning还要差不多200刀呢
【在 C*******e 的大作中提到】
: 倒是想开公司
: 不过开你说的这种公司太吃力不讨好了：）
: 哦，两年前好像有人在这里贴广告要找人做克隆的
: 一个克隆才出价100刀，还要10天内出货
: 我想了一下觉得实在不划算
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S******l
发帖数: 14311 | 41 可以直接用Mlu----BgII 策略（BglII和BamHI是同尾酶）。考虑到将来可以切下来，还
可以在BglII内侧加其他酶切位点。
【在 z*t 的大作中提到】
: 单酶切条件下insert磷酸化+vector去磷酸化能把自连降到多少？
: 现在想把一个cDNA subclone into another vector,但目的vector只有两个酶BamHI和
: MluI可以切，并且BamHI还会在cDNA内部有一个切点。。。除了单酶切，我还有什么办
: 法么？
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z*t
发帖数: 863 | 42 got it! That's a great idea!
【在 S******l 的大作中提到】
: 可以直接用Mlu----BgII 策略（BglII和BamHI是同尾酶）。考虑到将来可以切下来，还
: 可以在BglII内侧加其他酶切位点。
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M*****n
发帖数: 16729 | 43 molecular biology is not just pippetting.
an experienced molecular biology tech is so hard to find. |
