j***l
发帖数: 100 | 1 如果只想replace一段20bp,比如说将T7改成SP6,但旁边又没有什么restriction site,
什么方法最好? 可以用point mutation的方法么? | j****x
发帖数: 1704 | 2 如果质粒不特别大的话，感觉比较简单的策略就是NEB的突变策略。
在想删除的位点两侧设计“背靠背”引物（必须5'端磷酸化修饰），把你需要替换的序
列设计在引物上。扩增整个质粒，PCR产物就是线性化的目的质粒序列，然后self-
ligation即可。
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【在 j***l 的大作中提到】
: 如果只想replace一段20bp,比如说将T7改成SP6,但旁边又没有什么restriction site,
: 什么方法最好? 可以用point mutation的方法么?
| n******e
发帖数: 89 | 3 这个不难，用overlapping PCR，先做两段PCR产物含有SP6的，再融合一块，酶切后
进入同样切过的质粒。需要订4个引物，两端两个，中间含有SP6的两个。两端酶切位点
选择片段不长不短，几百个bp合适PCR的就好。
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【在 j***l 的大作中提到】
: 如果只想replace一段20bp,比如说将T7改成SP6,但旁边又没有什么restriction site,
: 什么方法最好? 可以用point mutation的方法么?
| o*****r
发帖数: 156 | 4 quikchange multi sites
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【在 j***l 的大作中提到】
: 如果只想replace一段20bp,比如说将T7改成SP6,但旁边又没有什么restriction site,
: 什么方法最好? 可以用point mutation的方法么?
| C*********m
发帖数: 213 | 5 en, good one. 用 InFusion，引物就不用磷酸化了，两个引物就可以了。
【在 j****x 的大作中提到】
: 如果质粒不特别大的话，感觉比较简单的策略就是NEB的突变策略。
: 在想删除的位点两侧设计“背靠背”引物（必须5'端磷酸化修饰），把你需要替换的序
: 列设计在引物上。扩增整个质粒，PCR产物就是线性化的目的质粒序列，然后self-
: ligation即可。
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