x********e
发帖数: 35261 | 1 据版上各位分子克隆大神说Gibson百发百中，正好我要克隆几个比较大的enhancer到9k
的质粒里，就试了一下。positive control连接转化没问题，但是我自己设计引物p出来
的片段跟载体死活连不上。是不是我的引物设计有问题？ |
w*e
发帖数: 740 | 2 你要先确定你的PCR产物序列没问题，有时候有带，即使是一条带，序列也未必一定对。
还有你的终产物如果大于12k，可能要换好点的菌株细胞，这样理论上效果好点
9k
出来
【在 x********e 的大作中提到】
: 据版上各位分子克隆大神说Gibson百发百中，正好我要克隆几个比较大的enhancer到9k
: 的质粒里，就试了一下。positive control连接转化没问题，但是我自己设计引物p出来
: 的片段跟载体死活连不上。是不是我的引物设计有问题？
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x********e
发帖数: 35261 | 3 我首先想的也是可能我的引物设计错了。但是我是直接用NEB的程序导入质粒和inserti
on的信息然后根据位置设计的引物啊。而且我把assemble后的产物跑胶看了，还是两个
条带
引物设计时同源序列的长度或者Tm有什么要求么?
对。
【在 w*e 的大作中提到】
: 你要先确定你的PCR产物序列没问题，有时候有带，即使是一条带，序列也未必一定对。
: 还有你的终产物如果大于12k，可能要换好点的菌株细胞，这样理论上效果好点
:
: 9k
: 出来
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s******s
发帖数: 13035 | 4 你几个片段啊？记得两片段很容易，三片段就克隆很少了
inserti
【在 x********e 的大作中提到】
: 我首先想的也是可能我的引物设计错了。但是我是直接用NEB的程序导入质粒和inserti
: on的信息然后根据位置设计的引物啊。而且我把assemble后的产物跑胶看了，还是两个
: 条带
: 引物设计时同源序列的长度或者Tm有什么要求么?
:
: 对。
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x********e
发帖数: 35261 | 5 就两片段，1：1连
【在 s******s 的大作中提到】
: 你几个片段啊？记得两片段很容易，三片段就克隆很少了
:
: inserti
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M******g
发帖数: 152 | 6 I've used Gibson Assembly more than twenty times and had no problem at all.
Tell me more details. I might be able to help.
how did you open up your vector? PCR or restriction enzymes?
It is better if you purify the pcr product.
don't use competent cells other than NEB. for some reason, it didn't work
well if use invitrogen cells etc.
Dh5alpha comp cell from NEB is better than NEB10 beta regarding
transformation efficiency. |
w*e
发帖数: 740 | 7 based on NEB website, it seems neb 10 beta is better than 5 alpha
.
【在 M******g 的大作中提到】
: I've used Gibson Assembly more than twenty times and had no problem at all.
: Tell me more details. I might be able to help.
: how did you open up your vector? PCR or restriction enzymes?
: It is better if you purify the pcr product.
: don't use competent cells other than NEB. for some reason, it didn't work
: well if use invitrogen cells etc.
: Dh5alpha comp cell from NEB is better than NEB10 beta regarding
: transformation efficiency.
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w*e
发帖数: 740 | 8 我原来做头几次也没问题
后来做复杂的质粒就出问题了，效率很低
请你来讲讲你的经验呀
I've used Gibson Assembly more than twenty times and had no problem at all.
Tell me more details. I might be able to help.
how did you open up your vector? PCR or restriction enzymes?
It is better if you purify the pcr product.
don't use competent cells other than NEB. for some reason, it didn't work
well if use invitrogen cells etc.
Dh5alpha comp cell from NEB is better than NEB10 beta regarding
transformation efficiency.
【在 M******g 的大作中提到】
: I've used Gibson Assembly more than twenty times and had no problem at all.
: Tell me more details. I might be able to help.
: how did you open up your vector? PCR or restriction enzymes?
: It is better if you purify the pcr product.
: don't use competent cells other than NEB. for some reason, it didn't work
: well if use invitrogen cells etc.
: Dh5alpha comp cell from NEB is better than NEB10 beta regarding
: transformation efficiency.
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w*e
发帖数: 740 | 9 接着这个问个问题
现在life technology也有geneart seamless cloning kit，clontech公司也有
infusion cloning kit，我个人感觉本质上这些kits和NEB gbison kits是一样的
不知道版上面有没有人比较过这几个，那个更稳定
.
【在 w*e 的大作中提到】
: 我原来做头几次也没问题
: 后来做复杂的质粒就出问题了，效率很低
: 请你来讲讲你的经验呀
:
: I've used Gibson Assembly more than twenty times and had no problem at all.
: Tell me more details. I might be able to help.
: how did you open up your vector? PCR or restriction enzymes?
: It is better if you purify the pcr product.
: don't use competent cells other than NEB. for some reason, it didn't work
: well if use invitrogen cells etc.
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x********e
发帖数: 35261 | 10 看网上有人说 关键在于T5和Phusion的比例
【在 w*e 的大作中提到】
: 接着这个问个问题
: 现在life technology也有geneart seamless cloning kit，clontech公司也有
: infusion cloning kit，我个人感觉本质上这些kits和NEB gbison kits是一样的
: 不知道版上面有没有人比较过这几个，那个更稳定
:
: .
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w*e
发帖数: 740 | 11 能深入讲讲？
不是很理解T5 phusion的比例这个东西
【在 x********e 的大作中提到】
: 看网上有人说 关键在于T5和Phusion的比例
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x********e
发帖数: 35261 | 12 你可以去网上搜Gibson cloning的原始paper, mix的主要成分就是T5和Phusion. NEB就
是改进了下比例。有人直接用那篇paper上给的recipe配,也能做
【在 w*e 的大作中提到】
: 能深入讲讲？
: 不是很理解T5 phusion的比例这个东西
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w*e
发帖数: 740 | 13 thanks,
【在 x********e 的大作中提到】
: 你可以去网上搜Gibson cloning的原始paper, mix的主要成分就是T5和Phusion. NEB就
: 是改进了下比例。有人直接用那篇paper上给的recipe配,也能做
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M******g
发帖数: 152 | 14 Tell me more about your 复杂的质粒. I had no problem so far.
.
【在 w*e 的大作中提到】
: 我原来做头几次也没问题
: 后来做复杂的质粒就出问题了，效率很低
: 请你来讲讲你的经验呀
:
: I've used Gibson Assembly more than twenty times and had no problem at all.
: Tell me more details. I might be able to help.
: how did you open up your vector? PCR or restriction enzymes?
: It is better if you purify the pcr product.
: don't use competent cells other than NEB. for some reason, it didn't work
: well if use invitrogen cells etc.
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