y********8
发帖数: 23 | 1 我用joint PCR将两个3k和4k的片段连接在一起， 结果除了7k的目的片段之外，始终有
一条很强的4k左右的片段，想请教如何去除4k的片段，我不想做gel cutting和再次PCR
，怕引入mutations.
谢谢！！！ |
e****s
发帖数: 1125 | 2 你确定这个4k的不是上轮那4k的片断？
你说的joint就是overlapping吧？overlapping PCR有很多做法，要看你的protocol才
能分析啊。比如是否加入primers?还是直接加入大量的A片断和B片断。 |
M******g
发帖数: 152 | 3 You should try Gibson assembly from NEB. It is very easy to assemble
fragments.
Learn more about Gibson assembly, check out the link below:
https://www.neb.com/applications/cloning-and-mapping/gibson-assembly |
b******k
发帖数: 1874 | 4 可以试试直接，连接，转化ecoli：
1 如果那4k的杂带没有对应的霉切位点，不会被链接。
2 如果转化了，有可能通过plasmid 电泳区分出来。
3 再不济，用菌落pcr筛选
PCR
【在 y********8 的大作中提到】
: 我用joint PCR将两个3k和4k的片段连接在一起， 结果除了7k的目的片段之外，始终有
: 一条很强的4k左右的片段，想请教如何去除4k的片段，我不想做gel cutting和再次PCR
: ，怕引入mutations.
: 谢谢！！！
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b*********b
发帖数: 64 | 5 gel purification没那么容易引入mutation的，只要你不用紫外使命的照。我做过的克
隆多到没法数，从来都做gel purification，2k以下的片段，我最多挑4个克隆去测序
，大部分时候是100%正确，还从来没遇到拿不到正确克隆的时候，而且做了gel
purification，会给你后来的几步省去很多麻烦。
照胶的时候放个尺子在你的gel旁边，这样你就知道该往哪割了。我用紫外最多不超过
30s。你要担心胶纯化后7k片段浓度太低，同时做几管PCR，全部跑胶。
PCR
【在 y********8 的大作中提到】
: 我用joint PCR将两个3k和4k的片段连接在一起， 结果除了7k的目的片段之外，始终有
: 一条很强的4k左右的片段，想请教如何去除4k的片段，我不想做gel cutting和再次PCR
: ，怕引入mutations.
: 谢谢！！！
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b******k
发帖数: 1874 | 6 我也同意。连接产物纯了，后面做起来会更顺利。
【在 b*********b 的大作中提到】
: gel purification没那么容易引入mutation的，只要你不用紫外使命的照。我做过的克
: 隆多到没法数，从来都做gel purification，2k以下的片段，我最多挑4个克隆去测序
: ，大部分时候是100%正确，还从来没遇到拿不到正确克隆的时候，而且做了gel
: purification，会给你后来的几步省去很多麻烦。
: 照胶的时候放个尺子在你的gel旁边，这样你就知道该往哪割了。我用紫外最多不超过
: 30s。你要担心胶纯化后7k片段浓度太低，同时做几管PCR，全部跑胶。
:
: PCR
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C*******e
发帖数: 4348 | 7 顶三楼
推荐Gibson Assembly
还有Clontech家的叫HD Fusion的
两个原理差不多
做出来没有scar，不需要考虑酶切的问题
总有一天传统酶切再连接的方法会退出舞台的 |
s******s
发帖数: 13035 | 8 gibson这个mix真tmd的死贵。有公司做山寨么，看上去成本没啥啥
【在 C*******e 的大作中提到】
: 顶三楼
: 推荐Gibson Assembly
: 还有Clontech家的叫HD Fusion的
: 两个原理差不多
: 做出来没有scar，不需要考虑酶切的问题
: 总有一天传统酶切再连接的方法会退出舞台的
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C*******e
发帖数: 4348 | 9 gibson的那个不知道有没有人山寨
HD Fusion那个据我所知有实验室自己制备mix的
好像是个特殊的菌种，然后用cell lysate作为mix
具体的没能打探到
【在 s******s 的大作中提到】
: gibson这个mix真tmd的死贵。有公司做山寨么，看上去成本没啥啥
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N2
发帖数: 81 | 10 We did Gibson just after his paper published and never buy kit.
Just need order enzymes and follow his protocol.
【在 C*******e 的大作中提到】
: gibson的那个不知道有没有人山寨
: HD Fusion那个据我所知有实验室自己制备mix的
: 好像是个特殊的菌种，然后用cell lysate作为mix
: 具体的没能打探到
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H*******i
发帖数: 196 | 11 各种方法都有优缺点，合理使用才是关键
如果要构建大量同系列克隆，酶切连接自然有优势（至少不用成天买primer），而且在
最后成环一步，酶切连接也是最robust的方法之一（有时二级结构对Gibson/Slic有点
影响，尤其是一律50°C的反应，基于PCR和recombination的问题就更多了。） Scar
只要用overlapping PCR解决就是了。
当然完全构建一个全新的，一次性的需要大量不同片段的东西，自然Gibson assembly
类方法有优势（做特别大的片段也有优势）
Gibson得话 T5 exonuclease https://www.neb.com/products/m0363-t5-exonuclease
Taq ligase https://www.neb.com/products/m0208-taq-dna-ligase
加上polymerase
就两三刀吧。
Slic一样片段，只用T4 DNApolymerase，两片段效率大概低两个数量级。
另外LZ你需不需要额外纯化是根据你片段性质来得，你7kb的是啥？ insert得话必须
纯化，无论什么方法（小片段干扰太大）。 Backbone如果你确定Ori和筛选基因不会
同时出现在4KB片段上得话，偷懒也可以。不过mutation肯定不是关键需要考虑的问题
。
【在 C*******e 的大作中提到】
: 顶三楼
: 推荐Gibson Assembly
: 还有Clontech家的叫HD Fusion的
: 两个原理差不多
: 做出来没有scar，不需要考虑酶切的问题
: 总有一天传统酶切再连接的方法会退出舞台的
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w********a
发帖数: 324 | 12 搭车问一个PCR的问题：
我用做完的PCR product，作为template，继续做PCR
，想得到更高浓度的产物；但总是不成功。要么干脆没有条带，要么有比较强的
unspecific的杂带。不知道您有什么好的建议。。
我试过用做完PCR的mixture直接作为template，也试过先clean-up一下，或者切胶纯化
一下，都不成功。不知道为什么？
非常感谢。
Scar
assembly
exonuclease
【在 H*******i 的大作中提到】
: 各种方法都有优缺点，合理使用才是关键
: 如果要构建大量同系列克隆，酶切连接自然有优势（至少不用成天买primer），而且在
: 最后成环一步，酶切连接也是最robust的方法之一（有时二级结构对Gibson/Slic有点
: 影响，尤其是一律50°C的反应，基于PCR和recombination的问题就更多了。） Scar
: 只要用overlapping PCR解决就是了。
: 当然完全构建一个全新的，一次性的需要大量不同片段的东西，自然Gibson assembly
: 类方法有优势（做特别大的片段也有优势）
: Gibson得话 T5 exonuclease https://www.neb.com/products/m0363-t5-exonuclease
: Taq ligase https://www.neb.com/products/m0208-taq-dna-ligase
: 加上polymerase
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C*******e
发帖数: 4348 | 13 这个说的在理
不过primer方面好像并没有能省什么
如果只是一个insert片段，的确两种方法区别不算大
但如果是好多个片段首尾相连，Gibson Assembly优势显而易见
特别是vector还有最终construct都比较大，很难选择restriction enzyme的时候（要
不就是要买新的很不常见的酶，要不就是某些fragment要先做mutation PCR去除要用的
酶切位点）
Scar
assembly
exonuclease
【在 H*******i 的大作中提到】
: 各种方法都有优缺点，合理使用才是关键
: 如果要构建大量同系列克隆，酶切连接自然有优势（至少不用成天买primer），而且在
: 最后成环一步，酶切连接也是最robust的方法之一（有时二级结构对Gibson/Slic有点
: 影响，尤其是一律50°C的反应，基于PCR和recombination的问题就更多了。） Scar
: 只要用overlapping PCR解决就是了。
: 当然完全构建一个全新的，一次性的需要大量不同片段的东西，自然Gibson assembly
: 类方法有优势（做特别大的片段也有优势）
: Gibson得话 T5 exonuclease https://www.neb.com/products/m0363-t5-exonuclease
: Taq ligase https://www.neb.com/products/m0208-taq-dna-ligase
: 加上polymerase
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H*******i
发帖数: 196 | 14 举个例子，如果你构建一大堆东西结构都是类似的，并且你需要尝试不同的组合
part1=Ori+resistance part2=upelements&promoter part3=rbs part4=cds
如果用gibson，要么使用一段长的共同序列作为连接部分，否则任意两个的组合都需要
一个引物，如果使用酶切连接，只需要在分割位点给一个scar就可以了（如果需要
seamless，可以使用BsaI类的酶）
至于我选用restriction enzyme，如果确定了，就会一直用下去，只是为了标准化构建
，不会去考虑cds里面有没有这种问题的（有就突变掉，如果因为有就要换酶那么当然
不如Gibson/CPEC类的策略）
【在 C*******e 的大作中提到】
: 这个说的在理
: 不过primer方面好像并没有能省什么
: 如果只是一个insert片段，的确两种方法区别不算大
: 但如果是好多个片段首尾相连，Gibson Assembly优势显而易见
: 特别是vector还有最终construct都比较大，很难选择restriction enzyme的时候（要
: 不就是要买新的很不常见的酶，要不就是某些fragment要先做mutation PCR去除要用的
: 酶切位点）
:
: Scar
: assembly
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H*******i
发帖数: 196 | 15 你说的不是很清楚，
不过在我实验中有很多情况，如果第一次PCR杂带比目标带小，1是引物多聚体 2是目标
片段自身有些二级结构,包括重复序列 3是引物可以binding到非特异位点。 很多情况
是解决不了的。
如果你的目的是克隆，那么只要在胶上能看到（设计没问题的话），基本就是可以做出
来的。
我一般就做两件事
1.检查引物，另外看看片段里有没有重复序列，很多早期载体/基因片段里面有很多乱
七八糟东西，比如pET系列载体里面有段tetracycline resistance gene残余什么的。
2.换酶，越是结构复杂，包括terminator，重复序列（反向重复），不同酶表现差异越
大。（我是不到没有办法从来不优化体系的）
【在 w********a 的大作中提到】
: 搭车问一个PCR的问题：
: 我用做完的PCR product，作为template，继续做PCR
: ，想得到更高浓度的产物；但总是不成功。要么干脆没有条带，要么有比较强的
: unspecific的杂带。不知道您有什么好的建议。。
: 我试过用做完PCR的mixture直接作为template，也试过先clean-up一下，或者切胶纯化
: 一下，都不成功。不知道为什么？
: 非常感谢。
:
: Scar
: assembly
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b*********b
发帖数: 64 | 16 通常引物与线性template末端binding不好，这种时候用两对引物比较好，第二对比第
一对往template中心移一点，移个四五个碱基就好了，有点像nested PCR。
【在 w********a 的大作中提到】
: 搭车问一个PCR的问题：
: 我用做完的PCR product，作为template，继续做PCR
: ，想得到更高浓度的产物；但总是不成功。要么干脆没有条带，要么有比较强的
: unspecific的杂带。不知道您有什么好的建议。。
: 我试过用做完PCR的mixture直接作为template，也试过先clean-up一下，或者切胶纯化
: 一下，都不成功。不知道为什么？
: 非常感谢。
:
: Scar
: assembly
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w********a
发帖数: 324 | 17 非常感谢你的回复。
我的意思是说，第一次PCR可以做出想要的条带。即便第一次PCR产物中没有其他非特异
性条带（或者通过切胶纯化想要的条带），然后再用这个产物作为template，用同样的
酶，同样的条件做二次PCR，却总是做不出来。。
另外，关于Gibson Assembly的Master Mix，放狗找到了下面的配方；看上去跟作者原
文中的配方基本差不多；不过有个如此详细的配方（有NEB的Cat. No.）还是比较省事
。。
哪位兄弟可以试试，回来汇报一下：
http://ethanomics.files.wordpress.com/2013/06/2x-gibson-assembl
http://ethanomics.wordpress.com/gibson-assembly-master-mix/
谢谢
【在 H*******i 的大作中提到】
: 你说的不是很清楚，
: 不过在我实验中有很多情况，如果第一次PCR杂带比目标带小，1是引物多聚体 2是目标
: 片段自身有些二级结构,包括重复序列 3是引物可以binding到非特异位点。 很多情况
: 是解决不了的。
: 如果你的目的是克隆，那么只要在胶上能看到（设计没问题的话），基本就是可以做出
: 来的。
: 我一般就做两件事
: 1.检查引物，另外看看片段里有没有重复序列，很多早期载体/基因片段里面有很多乱
: 七八糟东西，比如pET系列载体里面有段tetracycline resistance gene残余什么的。
: 2.换酶，越是结构复杂，包括terminator，重复序列（反向重复），不同酶表现差异越
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C*******e
发帖数: 4348 | 18 你说的不就是类似BglBricks的策略嘛
“不会去考虑cds里面有没有这种问题的（有就突变掉）”
——我说的就是这个问题啊，突变掉这一步也是需要设计引物、增加步骤的
而且这些BioBricks的策略还是要一步一步来组装
当然有的更复杂一些的，酶切位点不在识别位点上的，有可能一步来
反正各种方法各有利弊吧
一个看具体要做什么
另外就是看个人习惯了
没必要非争个长短
【在 H*******i 的大作中提到】
: 举个例子，如果你构建一大堆东西结构都是类似的，并且你需要尝试不同的组合
: part1=Ori+resistance part2=upelements&promoter part3=rbs part4=cds
: 如果用gibson，要么使用一段长的共同序列作为连接部分，否则任意两个的组合都需要
: 一个引物，如果使用酶切连接，只需要在分割位点给一个scar就可以了（如果需要
: seamless，可以使用BsaI类的酶）
: 至于我选用restriction enzyme，如果确定了，就会一直用下去，只是为了标准化构建
: ，不会去考虑cds里面有没有这种问题的（有就突变掉，如果因为有就要换酶那么当然
: 不如Gibson/CPEC类的策略）
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H*******i
发帖数: 196 | 19 我意思就是要看具体做什么灵活选择，而不是单纯比较策略好坏
比如构建A+B+C
其中A有x个 B有y个 C有Z个，我会在连接位置给三个酶切位点（个人觉得就算少量突
变也是值得的）。
如果是关键区域的组合，比如A-B中间是确定的序列，我会选择BsaI
如果是把一个片段加到所有质粒里（比如加tag），我会用Gibson assembly/CPEC（根
据插入片段长度，原质粒序列复杂度，当然也可以选择overlap PCR+酶切连接做）
构建新质粒，从时间上来说各个方法都差不多，因为Gibson对于多片段连接相对容易，
所以应该是最快的（不过片段太多也需要先PCR连起来），CPEC我只用两片段连接（有
时需要一次额外的overlapping PCR），酶切连接（三片段最多了）大概比CPEC多用1.
5h时间。 不过无论哪种方法，拿到引物后基本当天都能做完。。所以一般只考虑成功
率和后续实验设计问题。
【在 C*******e 的大作中提到】
: 你说的不就是类似BglBricks的策略嘛
: “不会去考虑cds里面有没有这种问题的（有就突变掉）”
: ——我说的就是这个问题啊，突变掉这一步也是需要设计引物、增加步骤的
: 而且这些BioBricks的策略还是要一步一步来组装
: 当然有的更复杂一些的，酶切位点不在识别位点上的，有可能一步来
: 反正各种方法各有利弊吧
: 一个看具体要做什么
: 另外就是看个人习惯了
: 没必要非争个长短
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C*******e
发帖数: 4348 | 20 赞“不过无论哪种方法，拿到引物后基本当天都能做完”
另外借楼贴一个科普贴
介绍几种cloning methods的
http://j5.jbei.org/j5manual/pages/22.html
【在 H*******i 的大作中提到】
: 我意思就是要看具体做什么灵活选择，而不是单纯比较策略好坏
: 比如构建A+B+C
: 其中A有x个 B有y个 C有Z个，我会在连接位置给三个酶切位点（个人觉得就算少量突
: 变也是值得的）。
: 如果是关键区域的组合，比如A-B中间是确定的序列，我会选择BsaI
: 如果是把一个片段加到所有质粒里（比如加tag），我会用Gibson assembly/CPEC（根
: 据插入片段长度，原质粒序列复杂度，当然也可以选择overlap PCR+酶切连接做）
: 构建新质粒，从时间上来说各个方法都差不多，因为Gibson对于多片段连接相对容易，
: 所以应该是最快的（不过片段太多也需要先PCR连起来），CPEC我只用两片段连接（有
: 时需要一次额外的overlapping PCR），酶切连接（三片段最多了）大概比CPEC多用1.
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C**S
发帖数: 522 | 21 谢谢科普贴。
【在 C*******e 的大作中提到】
: 赞“不过无论哪种方法，拿到引物后基本当天都能做完”
: 另外借楼贴一个科普贴
: 介绍几种cloning methods的
: http://j5.jbei.org/j5manual/pages/22.html
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d****i
发帖数: 2346 | |
h**********r
发帖数: 671 | 23 我准备考虑Gibson assembly了，先问你一个很挫的问题哈。
1).比如我用EcoRI线性化质粒，作为assembly的一部分。切开后是这样子的吧？
------G AATTC-------
------CTTAA G-------
vector的两头不是平末端了，应该怎么设计overlap啊？还是两边直接用EcoRI (GAATTC
)的序列？感觉又不完全互补了。如果用overhang的话，只和一条链互补，那样EcoRI就
没了？这个nick是咋整的呢？
2).另外今天又挫了一把，在IDT合成两个片段忘记加overlap了。只能再靠PCR的引物加
这个overlap。他家的750bp-510bp一个价。应该刚好合成到750bp左右。这个overlap多
长比较合适？NEB说20bp多够了,有的说不够。
2).另外一个问题：可以把Gibson assembly的产物直接作为模板PCR得到全长吧？要表
达的制粒不方便测序。想把得到PCR产物一部分用来酶切克隆表达，一部分用来AT克隆
测序。
多谢了！
【在 C*******e 的大作中提到】
: 这个说的在理
: 不过primer方面好像并没有能省什么
: 如果只是一个insert片段，的确两种方法区别不算大
: 但如果是好多个片段首尾相连，Gibson Assembly优势显而易见
: 特别是vector还有最终construct都比较大，很难选择restriction enzyme的时候（要
: 不就是要买新的很不常见的酶，要不就是某些fragment要先做mutation PCR去除要用的
: 酶切位点）
:
: Scar
: assembly
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C*******e
发帖数: 4348 | 24 对于问题（1），就是你把自己最后要得到的质粒用手画也好，用软件也好，序列整出来
把inseert的部分highlight
就可以看的比较清楚了
决定好insert的部分以后，再往上游数个15－20bp（看手册怎么说）就可以
Gibson的是从5'端chew back
你可以选择保留质粒上的酶切位点（比如你这里的EcoRI）或者不保留
看你需要
所以如果保留位点就是
------G AATTinsert AATTC-------
------CTTAA insertTTAA G-------
如果不保留位点，就是这样：
------G insert （AATTC）-------
------C（TTAA） insert G-------
（括号里面因为5' chew back，而且insert上的flanking region不带这个“AATT”，
就失去了）
我一般还是选择保留酶切位点，这样的好处是如果这个片段我以后还想用来做别的
我还是可以用酶切的方法取出来，而不用再设计一次引物
另外没有明白第二个问题
如果你已经在合成一个基因了，干嘛不一步到位，而是还要自己折腾啊？
GAATTC
【在 h**********r 的大作中提到】
: 我准备考虑Gibson assembly了，先问你一个很挫的问题哈。
: 1).比如我用EcoRI线性化质粒，作为assembly的一部分。切开后是这样子的吧？
: ------G AATTC-------
: ------CTTAA G-------
: vector的两头不是平末端了，应该怎么设计overlap啊？还是两边直接用EcoRI (GAATTC
: )的序列？感觉又不完全互补了。如果用overhang的话，只和一条链互补，那样EcoRI就
: 没了？这个nick是咋整的呢？
: 2).另外今天又挫了一把，在IDT合成两个片段忘记加overlap了。只能再靠PCR的引物加
: 这个overlap。他家的750bp-510bp一个价。应该刚好合成到750bp左右。这个overlap多
: 长比较合适？NEB说20bp多够了,有的说不够。
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h**********r
发帖数: 671 | 25 谢谢，解释得非常清楚。我用软件画质粒的。酶切连接克隆做了也不下几千个了。你这
个5' chew back解释得非常好，Gibson assembly把这个给削平了。就是说这个也可以
和yeast recombination一样，中间引入一小段和两头儿都不同源的序列。
是因为最近IDT公司只合成750bp以下比较便宜，所以我分段合成，然后要assembly。猥
琐了一把。
多谢！ |
