j****x
发帖数: 1704 | 1 载体外加三个片段，vector-HindIII-insert1-BspEI-insert2-SpeI-insert3-SmaI-
vector
这种连接的效率低是必然的了，而且3’端还是个blunt end（SmaI）。想请教一下有没
有什么tips可以提高成功率？谢谢！ |
s********n
发帖数: 2939 | 2 加PEG，用电转，colony PCR screening |
g*********5
发帖数: 2533 | 3 can you use gibson fragment? |
s******s
发帖数: 13035 | 4 多长啊
【在 j****x 的大作中提到】
: 载体外加三个片段，vector-HindIII-insert1-BspEI-insert2-SpeI-insert3-SmaI-
: vector
: 这种连接的效率低是必然的了，而且3’端还是个blunt end（SmaI）。想请教一下有没
: 有什么tips可以提高成功率？谢谢！
|
e****s
发帖数: 1125 | 5 SmaI可以用XmaI代替，就成Stick end了。
3 way ligation做过不少。4个没弄过。 |
s******s
发帖数: 13035 | 6 加PEG啥的，试一下唄。不成的话，三个insert先连，然后PCR一下，
再和载体搞总行吧
【在 j****x 的大作中提到】
: 载体外加三个片段，vector-HindIII-insert1-BspEI-insert2-SpeI-insert3-SmaI-
: vector
: 这种连接的效率低是必然的了，而且3’端还是个blunt end（SmaI）。想请教一下有没
: 有什么tips可以提高成功率？谢谢！
|
j****x
发帖数: 1704 | 7 nope，包含大段的重复序列，所以才考虑这种连接方式...
【在 g*********5 的大作中提到】
: can you use gibson fragment?
|
j****x
发帖数: 1704 | 8 载体3kb出头，每个插入约1kb
【在 s******s 的大作中提到】
: 多长啊
|
j****x
发帖数: 1704 | 9 这个有考虑过，但XmaI木有fastdigest版本...
【在 e****s 的大作中提到】
: SmaI可以用XmaI代替，就成Stick end了。
: 3 way ligation做过不少。4个没弄过。
|
j****x
发帖数: 1704 | 10 PCR没戏，insert1和insert3有大段重复序列，本身就是单独DNA合成出来的。
先试试看吧，不行再一个片段一个片段的整
【在 s******s 的大作中提到】
: 加PEG啥的，试一下唄。不成的话，三个insert先连，然后PCR一下，
: 再和载体搞总行吧
|
|
|
m*******u
发帖数: 173 | 11 Can you use 3-way gateway cloning, if you don't mind a bit junction attB
site between each fragment. |
x********e
发帖数: 35261 | 12 克隆genomic sequence？如果是酶切位点不够的话，用gibson cloning
【在 j****x 的大作中提到】
: 载体外加三个片段，vector-HindIII-insert1-BspEI-insert2-SpeI-insert3-SmaI-
: vector
: 这种连接的效率低是必然的了，而且3’端还是个blunt end（SmaI）。想请教一下有没
: 有什么tips可以提高成功率？谢谢！
|
s*****i
发帖数: 315 | 13 做出来过，比三片段低很多，最好不要用blunt end，Xma1 还行，可以先放进去多切一
会儿
三片段大概能做到60%到80%成功率
四段也就10%吧
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.7
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.7
【在 j****x 的大作中提到】
: 载体外加三个片段，vector-HindIII-insert1-BspEI-insert2-SpeI-insert3-SmaI-
: vector
: 这种连接的效率低是必然的了，而且3’端还是个blunt end（SmaI）。想请教一下有没
: 有什么tips可以提高成功率？谢谢！
|
x*****e
发帖数: 309 | 14 好办法，能发个详细protocol link 不 ？ 多谢
【在 s********n 的大作中提到】
: 加PEG，用电转，colony PCR screening
|
s********n
发帖数: 2939 | 15 没有详细的protocol，就是几个要点
1)制备好vector，确保极低自连
2)平末端连接，加PEG
3)加大insert和vector的比例,5:1 to 10:1
4)电转，1E9 to 1E10
5)colony PCR screening，只要高于1%都没问题(96-well plate PCR reactions)，跑
一两个大胶
【在 x*****e 的大作中提到】
: 好办法，能发个详细protocol link 不 ？ 多谢
|
M******g
发帖数: 152 | 16 Gibson Assembly from NEB |
T****u
发帖数: 424 | 17 try Gibson assembly
【在 j****x 的大作中提到】
: 载体外加三个片段，vector-HindIII-insert1-BspEI-insert2-SpeI-insert3-SmaI-
: vector
: 这种连接的效率低是必然的了，而且3’端还是个blunt end（SmaI）。想请教一下有没
: 有什么tips可以提高成功率？谢谢！
|
j****x
发帖数: 1704 | 18 前面解释过了，由于存在大段重复序列（insert1和insert3有80%的区域是完全一致的
），所以用Gibson Assembly不太合适。
【在 T****u 的大作中提到】
: try Gibson assembly
|
s******s
发帖数: 13035 | 19 我还以为都同源呢。你1，3同源，先把1，2连起来不就可以做3 frag ligation了？
我当年做200多nt首尾大量同源的片段，还是order了十条五十多单链DNA，
然后1－6一起连，7-10一起连，最后做的3片段连接
【在 j****x 的大作中提到】
: 前面解释过了，由于存在大段重复序列（insert1和insert3有80%的区域是完全一致的
: ），所以用Gibson Assembly不太合适。
|
j****x
发帖数: 1704 | 20 yeap,眼下就是打算这么干了。
重复序列就是麻烦，本来想干脆123合在一起一块儿合成了算了，后来看了下价格和交
货时间，还是交给technician去做省钱省时间。当然，首先得保证制定的策略不出大篓
子。
【在 s******s 的大作中提到】
: 我还以为都同源呢。你1，3同源，先把1，2连起来不就可以做3 frag ligation了？
: 我当年做200多nt首尾大量同源的片段，还是order了十条五十多单链DNA，
: 然后1－6一起连，7-10一起连，最后做的3片段连接
|
|
|
x********e
发帖数: 35261 | 21 你不能先把1，3连载体里，再切一刀把2放中间？
【在 j****x 的大作中提到】
: 前面解释过了，由于存在大段重复序列（insert1和insert3有80%的区域是完全一致的
: ），所以用Gibson Assembly不太合适。
|
a**t
发帖数: 57 | 22 分成两步克隆效率高多了吧
【在 j****x 的大作中提到】
: 载体外加三个片段，vector-HindIII-insert1-BspEI-insert2-SpeI-insert3-SmaI-
: vector
: 这种连接的效率低是必然的了，而且3’端还是个blunt end（SmaI）。想请教一下有没
: 有什么tips可以提高成功率？谢谢！
|
a*******a
发帖数: 4233 | 23 我做过类似的，和你不太一样的是三个片段是合成然后anneal的，都是粘性末端
挺难做的，不过最后还是搞出来了。
【在 j****x 的大作中提到】
: 载体外加三个片段，vector-HindIII-insert1-BspEI-insert2-SpeI-insert3-SmaI-
: vector
: 这种连接的效率低是必然的了，而且3’端还是个blunt end（SmaI）。想请教一下有没
: 有什么tips可以提高成功率？谢谢！
|
s******e
发帖数: 370 | 24 clontech新出了一个in-fusion system，可能对lz有用，有时间不妨研究一下 |
e**e
发帖数: 166 | 25 you may try GeneArt from invitrogen. |
