h*********9
发帖数: 361 | 1 版上时不时就有人上来问克隆问题，我就简单说一下个人的一点点经验：
克隆的第一步一般都是从PCR开始的。PCR关键是引物设计。推荐用免费的primer3。手
动设计注意引物一般GC含量45%-55%。长度在20-24之间。3'端最好不要有很多GC在一起
（40%即可）,以减少非特异产物。内切酶位点一般加在引物的5'端，最好有4-6个以上
保护碱基以利酶切（很多酶对此有硬性要求，详情参见NEB目录）。设计好的引物可以
到www.idtdna.com察看二级结构等引物信息。
第二步酶切（当然也可用TA克隆法）很关键，一定要酶切彻底才会有较高的连接效率，
我的经验是对大多数质粒，一个微克用NEB的酶1微升（10-20 U）/3-4小时，50微升体
系。PCR产物酶量要适度增加因为长度短末端多。难切的酶可酌量延长时间或加大酶量(
难不难切可参见NEB每个酶后面的说明：After a XXX-fold overdigestion with XhoI,
> 95% of the DNA fragments can be ligated with T4 DNA Ligase (at a 5'
term |
E**O
发帖数: 62 | 2 怎么都没人顶。。。
量(
XhoI,
【在 h*********9 的大作中提到】
: 版上时不时就有人上来问克隆问题，我就简单说一下个人的一点点经验：
: 克隆的第一步一般都是从PCR开始的。PCR关键是引物设计。推荐用免费的primer3。手
: 动设计注意引物一般GC含量45%-55%。长度在20-24之间。3'端最好不要有很多GC在一起
: （40%即可）,以减少非特异产物。内切酶位点一般加在引物的5'端，最好有4-6个以上
: 保护碱基以利酶切（很多酶对此有硬性要求，详情参见NEB目录）。设计好的引物可以
: 到www.idtdna.com察看二级结构等引物信息。
: 第二步酶切（当然也可用TA克隆法）很关键，一定要酶切彻底才会有较高的连接效率，
: 我的经验是对大多数质粒，一个微克用NEB的酶1微升（10-20 U）/3-4小时，50微升体
: 系。PCR产物酶量要适度增加因为长度短末端多。难切的酶可酌量延长时间或加大酶量(
: 难不难切可参见NEB每个酶后面的说明：After a XXX-fold overdigestion with XhoI,
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R******E
发帖数: 159 | 3 这个要顶
曾经用过一次磷酸化
结果比不用的self-ligation更高
haohaohao99
方便的话
可不可以帖下
你用的protocol?
量(
XhoI,
【在 h*********9 的大作中提到】
: 版上时不时就有人上来问克隆问题，我就简单说一下个人的一点点经验：
: 克隆的第一步一般都是从PCR开始的。PCR关键是引物设计。推荐用免费的primer3。手
: 动设计注意引物一般GC含量45%-55%。长度在20-24之间。3'端最好不要有很多GC在一起
: （40%即可）,以减少非特异产物。内切酶位点一般加在引物的5'端，最好有4-6个以上
: 保护碱基以利酶切（很多酶对此有硬性要求，详情参见NEB目录）。设计好的引物可以
: 到www.idtdna.com察看二级结构等引物信息。
: 第二步酶切（当然也可用TA克隆法）很关键，一定要酶切彻底才会有较高的连接效率，
: 我的经验是对大多数质粒，一个微克用NEB的酶1微升（10-20 U）/3-4小时，50微升体
: 系。PCR产物酶量要适度增加因为长度短末端多。难切的酶可酌量延长时间或加大酶量(
: 难不难切可参见NEB每个酶后面的说明：After a XXX-fold overdigestion with XhoI,
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s********s
发帖数: 84 | 4 顶一下。。。能不能别的东西的经验啊。。
比如produce lentivirus
为啥titer很高，就是不表达目标蛋白啊。。（plasmid是对的。做transfection可以表
达目标蛋白，但是produce lentivirus以后，用virus做infection就检测不到目标蛋白
了。。） 可不可以告诉俺这是为啥啊。。
当然了，这个问题跟LZ分享的东西无关。。不能回答也没关系。。就当我纯抱怨啊T T |
a****m
发帖数: 693 | |
r***e
发帖数: 2539 | 6 怎么测的titer啊？p24不可靠，空的包装也能测很高。
感觉像是载体重组了，没被有效包装。
T
【在 s********s 的大作中提到】
: 顶一下。。。能不能别的东西的经验啊。。
: 比如produce lentivirus
: 为啥titer很高，就是不表达目标蛋白啊。。（plasmid是对的。做transfection可以表
: 达目标蛋白，但是produce lentivirus以后，用virus做infection就检测不到目标蛋白
: 了。。） 可不可以告诉俺这是为啥啊。。
: 当然了，这个问题跟LZ分享的东西无关。。不能回答也没关系。。就当我纯抱怨啊T T
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r***e
发帖数: 2539 | 7 转化前
最好70度10分钟，可以提高转化效率10倍左右。 |
n********k
发帖数: 2818 | 8 Super, Thanks and Ding...
BTW, a bit too general for me:))I was mostly interested in your way of
constructing targeting vector with so
fast speed...I am very experienced with cloning too...would wanna know ur
speedy way on making targeting
vectors...
量(
XhoI,
【在 h*********9 的大作中提到】
: 版上时不时就有人上来问克隆问题，我就简单说一下个人的一点点经验：
: 克隆的第一步一般都是从PCR开始的。PCR关键是引物设计。推荐用免费的primer3。手
: 动设计注意引物一般GC含量45%-55%。长度在20-24之间。3'端最好不要有很多GC在一起
: （40%即可）,以减少非特异产物。内切酶位点一般加在引物的5'端，最好有4-6个以上
: 保护碱基以利酶切（很多酶对此有硬性要求，详情参见NEB目录）。设计好的引物可以
: 到www.idtdna.com察看二级结构等引物信息。
: 第二步酶切（当然也可用TA克隆法）很关键，一定要酶切彻底才会有较高的连接效率，
: 我的经验是对大多数质粒，一个微克用NEB的酶1微升（10-20 U）/3-4小时，50微升体
: 系。PCR产物酶量要适度增加因为长度短末端多。难切的酶可酌量延长时间或加大酶量(
: 难不难切可参见NEB每个酶后面的说明：After a XXX-fold overdigestion with XhoI,
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n********k
发帖数: 2818 | 9 promoter silencing? if u put down the details, some of us here might be able
to figure out something...
T
【在 s********s 的大作中提到】
: 顶一下。。。能不能别的东西的经验啊。。
: 比如produce lentivirus
: 为啥titer很高，就是不表达目标蛋白啊。。（plasmid是对的。做transfection可以表
: 达目标蛋白，但是produce lentivirus以后，用virus做infection就检测不到目标蛋白
: 了。。） 可不可以告诉俺这是为啥啊。。
: 当然了，这个问题跟LZ分享的东西无关。。不能回答也没关系。。就当我纯抱怨啊T T
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n********k
发帖数: 2818 | 10 I recall is to both promote the completion of ligation and meanwhile to kill
the ligase...
【在 r***e 的大作中提到】
: 转化前
: 最好70度10分钟，可以提高转化效率10倍左右。
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s********s
发帖数: 84 | 11 测基本上是，是把得到的virus稀释后 infect细胞 然后用抗生素blasticidin 选出来
有抗性的以后 染色 数有多少colony。
载体重组了。。如果是这个原因 有啥办法呢。。只能换载体么。。
to neverthink 更多的细节啊
是用PENTR3C （里面有表达目标蛋白的gene）
然后和 plenti6/V5-DEST 做LR recombination
得到colony做酶切 看看位点之类的对不对
最后得到plasmid （用来做transfection之类的能得到蛋白表达）
用这个plasmind然后和pLP1, pLP2, pLP/VSVG之类的一起transfection 293T 细胞
得到virus
然后infection 然后检测蛋白没有。。
曾经用同样的办法做了几批virus，曾经有一批是能检测出来的。
但是后来我再做就不行了= =
反反复复几次以后 老板就让我重做一遍vector 就是从PENTR3C和自己目标蛋白gene 酶
切，ligation那步开始重做。也不说为啥要这样。一摸一样的方法重做一遍会有啥改变
么。。
PENTR3C这个原始的载
【在 r***e 的大作中提到】
: 怎么测的titer啊？p24不可靠，空的包装也能测很高。
: 感觉像是载体重组了，没被有效包装。
:
: T
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n********k
发帖数: 2818 | 12 Could you please do a transient transfection for me to the target cellls for
me and also do western to check
whether the protein is expressed in 293 cells(just collect the cells after
your collect the supertant for virus? I
suspect two things: either promoter silencing in ur target cells or ur
construct is bad...or it could be ur protein
is very tightly regulated posttranscriptionally, anyway, there could be many
possibility for this to happen...
【在 s********s 的大作中提到】
: 测基本上是，是把得到的virus稀释后 infect细胞 然后用抗生素blasticidin 选出来
: 有抗性的以后 染色 数有多少colony。
: 载体重组了。。如果是这个原因 有啥办法呢。。只能换载体么。。
: to neverthink 更多的细节啊
: 是用PENTR3C （里面有表达目标蛋白的gene）
: 然后和 plenti6/V5-DEST 做LR recombination
: 得到colony做酶切 看看位点之类的对不对
: 最后得到plasmid （用来做transfection之类的能得到蛋白表达）
: 用这个plasmind然后和pLP1, pLP2, pLP/VSVG之类的一起transfection 293T 细胞
: 得到virus
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s********s
发帖数: 84 | 13 谢谢。。western blot，免疫荧光都作过了。。
只要是transient transfection 不管是WB还是免疫荧光都可以出来。。
不过我倒是真的没有检测过用来packing的293里面有没有蛋白。。我可以试试，但是我
觉得应该是有的
就是从用293细胞produce virus开始，往后就不行了。。
如果是promoter silencing的话 是不是就没别的办法了。。
不知道为啥以前是怎么做出来一次的。。要是从来没做出来过，也就死心了 没啥好说的
曾经做出来过可以用的virus，出了一些结果，然后把那批virus用完了。。之后就再也
做不出来能用的了。。plasmid都是同一管啊。。
好吧。。其实我也知道这问题只有上帝才能回答。。要那么容易回答，我老板早就回答
我了，他也说有些问题就算是作virus很多年的人也不一定能搞明白啥问题，但是问题
在于老天，能不能让我突然很好运的把这个virus毫无理由的再做出来一次么。。
不管能不能解决问题，我谢谢回答了我问题的人。。至少我抱怨了。。= =
for
many
【在 n********k 的大作中提到】
: Could you please do a transient transfection for me to the target cellls for
: me and also do western to check
: whether the protein is expressed in 293 cells(just collect the cells after
: your collect the supertant for virus? I
: suspect two things: either promoter silencing in ur target cells or ur
: construct is bad...or it could be ur protein
: is very tightly regulated posttranscriptionally, anyway, there could be many
: possibility for this to happen...
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