再问gateway cloning - Biology版

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Biology版 - 再问gateway cloning

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相关话题的讨论汇总
话题: gateway话题: pcr话题: 载体话题: cloning话题: colony

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b******s
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本来容易的gateway cloning成了最近几个月摧毁我身心健康的罪魁祸首。
哎，说来话长。先来介绍背景：1年前开始用gateway做克隆。在此之前实验室也一直用
gateway，但是实验室很小，我之前只有一个日本博后。做了好几年。几乎所有的东西
都是从他那里来。我们用的是multisite gateway，细说就是三个entry clone和载体一
起连。
我做了N次（我都不好意思说N等于多少了），一个确定的都没成功。
症状：每次连接之后转e coli都有菌落，而且菌落看起来正常。介入液体摇也正常生长
（spectinomycin resistance）。但是colony PCR有时会有不浓的bands，size貌似正
确，但是很多时候PCR失败。提plasmid PCR也失败，酶切也失败。
可能一：entry clone有问题。用gateway做entry clone很容易，应该不会，我做了好
几个entry clone，都sequence过，PCR检测等很正常。
可能二：我哪里做错了。至少我现在想起来应该没有。我经过无数次改进，从反应DNA
浓度到反应时间到heat shock转化，我实在想不出来哪里还会有问题。而且我用其他
destination vector（非三片段的）做LR反应也没有问题。
可能三：这是我后来一直怀疑的。就是载体有问题。我试着用空载体转过DH5alpha发现
竟然也有colony。从那以后，我就比较警觉，觉得日本博后给我的载体可能有问题。我
就直接用他刚用过并成功过的载体直接扩增。提质粒再转染，这次没有false positive
colony了。但是比奇怪的是，用新的载体做结果还跟以前一样。但是似乎colony不如
以前多。（忘了补充，我以前做三片段连接常能长出30+ colony来，现在少了一些，5-
20的样子）
可能四：就是其他试剂被污染。真是神了。日本博后同时用同样的方法做，都成功。奇
怪的是，我找其他实验室借材料做其他克隆，都能成功，就是用本实验室的材料做
mutisite gateway没法成功。
我也怀疑过日本博后，在课题某些方面我们有竞争。但是我觉得认为破坏应该可能性很
小！我整天在实验室，比他待的时间长。另外他也看起来老实的样子。而且现在载体
PCR酶切都对。我不知道还有什么可以怀疑的。难道我的entry vector被加了啥？
有人劝我换传统的方法做克隆，可是。。。我们那么多entry vector都做好了现成的。
而且那日本博后一直成功，怎么就我一直失败。。。没道理啊。
一个简单的实验，反反复复的失败。已经把我折磨成祥林嫂。希望有耐心的同学看完了
絮叨给我建议，让我早点变回正常人。谢谢

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