d****i
发帖数: 2346 | 1 自己做了一个T vector，是把含有XcmI的 linker连进载体，然后酶切得到的。连接后
拿到质粒去测序和设计的一样。但是当PCR产物连接进去以后再测序回来发现，连接进
去的不知道是啥东西，和PCR产物一点都不一样，也找不到载体的下半部分了(我是用载
体上游引物测序的)。56个clone都是这样。
大家能不能给我一点提示什么的，我对此怎么都理解不了，不知道哪里出错了。
谢谢！ |
b******n
发帖数: 4225 | 2 呵呵，省点钱不容易
得花精力进去
对了，你用的什么backbone，pUC19?
【在 d****i 的大作中提到】
: 自己做了一个T vector，是把含有XcmI的 linker连进载体，然后酶切得到的。连接后
: 拿到质粒去测序和设计的一样。但是当PCR产物连接进去以后再测序回来发现，连接进
: 去的不知道是啥东西，和PCR产物一点都不一样，也找不到载体的下半部分了(我是用载
: 体上游引物测序的)。56个clone都是这样。
: 大家能不能给我一点提示什么的，我对此怎么都理解不了，不知道哪里出错了。
: 谢谢！
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d****i
发帖数: 2346 | 3 backbone是我们实验室以前做的一个载体,具体最早是怎么来的我没有去追究.
太奇怪了!我对比了测序结果,也不是selfligation,不知道什么连进去了,而且PCR产物
600bp，测序1000多后半段也找不到了. |
s********n
发帖数: 2939 | 4 你可以试试用酶切看看插入的片段有多大。
【在 d****i 的大作中提到】
: backbone是我们实验室以前做的一个载体,具体最早是怎么来的我没有去追究.
: 太奇怪了!我对比了测序结果,也不是selfligation,不知道什么连进去了,而且PCR产物
: 600bp，测序1000多后半段也找不到了.
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d****i
发帖数: 2346 | 5 测序后发现只有上游的酶切位点保留，不明插入片段下游的酶切位点都消失了。
很郁闷！
【在 s********n 的大作中提到】
: 你可以试试用酶切看看插入的片段有多大。
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s********n
发帖数: 2939 | 6 我的意思是可能你的插入片段太大，测序没有cover。你也可以试试用反向引物测序一下
【在 d****i 的大作中提到】
: 测序后发现只有上游的酶切位点保留，不明插入片段下游的酶切位点都消失了。
: 很郁闷！
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p****p
发帖数: 3360 | 7 TA cloning 需要vector上两头都是3' T-overhang. 单个XcmI不行的。
edit：如果要自己做T-vector, 恐怕还是得老老实实blunt end ＋ T。或者两个XcmI，各产生一个3' T。
【在 d****i 的大作中提到】
: 自己做了一个T vector，是把含有XcmI的 linker连进载体，然后酶切得到的。连接后
: 拿到质粒去测序和设计的一样。但是当PCR产物连接进去以后再测序回来发现，连接进
: 去的不知道是啥东西，和PCR产物一点都不一样，也找不到载体的下半部分了(我是用载
: 体上游引物测序的)。56个clone都是这样。
: 大家能不能给我一点提示什么的，我对此怎么都理解不了，不知道哪里出错了。
: 谢谢！
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d****i
发帖数: 2346 | 8 我用的就是2个XcmI，而且还有间隔序列。
，各产生一个3' T。
【在 p****p 的大作中提到】
: TA cloning 需要vector上两头都是3' T-overhang. 单个XcmI不行的。
: edit：如果要自己做T-vector, 恐怕还是得老老实实blunt end ＋ T。或者两个XcmI，各产生一个3' T。
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s******r
发帖数: 2876 | 9 把你测得序列blast一下，看看到底是什么污染。
自己做了一个T vector，是把含有XcmI的 linker连进载体，然后酶切得到的。连接后
拿到质粒去测序和设计的一样。但是当PCR产物连接进去以后再测序回来发现，连接进
去的不知道是啥东西，和PCR产物一点都不一样，也找不到载体的下半部分了(我是用载
体上游引物测序的)。56个clone都是这样。
大家能不能给我一点提示什么的，我对此怎么都理解不了，不知道哪里出错了。
谢谢！
【在 d****i 的大作中提到】
: 自己做了一个T vector，是把含有XcmI的 linker连进载体，然后酶切得到的。连接后
: 拿到质粒去测序和设计的一样。但是当PCR产物连接进去以后再测序回来发现，连接进
: 去的不知道是啥东西，和PCR产物一点都不一样，也找不到载体的下半部分了(我是用载
: 体上游引物测序的)。56个clone都是这样。
: 大家能不能给我一点提示什么的，我对此怎么都理解不了，不知道哪里出错了。
: 谢谢！
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s********n
发帖数: 2939 | 10 题外话：貌似GC cloning的效率比TA cloning的高不少。 |
