b*******6
发帖数: 39 | 1 我4个月前硕士毕业来德国
一个挺好的大学 拿的是老板给的奖学金 不是国家奖学金
老板是我们这行的大牛 说实话 人也不错
刚开始的课题1个是克隆，把一个蛋白加上不同的tag插到pQE8或者pQE60的载体里面去
载体选的位点是BamH1和Hind3，片段的酶切位点用的是Bgl2（因为片段里面有BamH1位
点）和Hind3，因为要在N段和C段加上10+aa大小的tag，所以一般引物都很长，50-80bp
本来想用pQE9而不是pQE8，但实验室里面没有9，BamH1和Hind3在8里面中间就隔了1个
碱基
第二个课题是用Dpn1酶构建不同的突变株
用pQE8的那个载体死活折腾不出来，前前后后大概4个月，另外2个倒是很顺利
第一次和老板谈活是在来这边3个月后，他说我是来读博士的，不应该在克隆这种小事
上折腾，应该很简单；第二次，就是昨天，他看到我pQE8最后一次克隆的结果：仅有几
个克隆，送过去测序，要做的8个构建株里面只有一个对的，其他基本上都是在Bgl2那
一段的引物地方要么有突变要么就是缺失。然后就发火了，叫我2个月以内结束实验室
课题走人。
来这边4个月，除了开始阶段适应外，基本上都在整这个克隆，想了好多的可能原因，
但是就一直没出来，自己心里也很郁闷。听有人说，如果到一个新的实验室，2周克隆
不出来，就会被赶走人；但是很郁闷，这个不管我怎么做，就是不出来；一次次看到光
秃秃的平板或者长满好多的对照板，就越觉得自己不该在这一行，自己的基础可能太差
了，这边除了实验汇报，生活基本是德语，交流又不多，所以生活也很郁闷。
看到周围那些同学不是旅游就是逛街，觉得人和人之间差距就是这么大。
生活就是一团糟糕，让人太难承受,上来抱怨一下。 |
p********o
发帖数: 29 | 2 你的确不应该花太多时间做技术上的事情而要着眼于整个课题
不过这个老板也太......tough了吧
读博士，听老板的话还是很重要的 |
b*******6
发帖数: 39 | 3 但是这个是开始，课题必须要用到这些质粒
更关键的是，周围的人特别是我实验室的师兄（也是中国人）说老板其实很不错，所以
自己对自己就更感到失败了，本身本身克隆做不出来，我也很郁闷；而且他是我们这行
的大牛，也很喜欢做这行，但是现在自己丢失到这个机会，很苦闷，想在这行找其他实
验室都不太容易了，老板基本都很熟
当然安慰自己的说法可能是，老板说没申请到基金
现在关键的是要在这2个月以内找到下家，稍微可以安慰的是，就在那次谈话不久，他
告诉我已经通过研究生院考试可以注册了，所以可以在学校里面找到一个老板，而不是
去其他城市
但是自己觉得很累，还不如回国找个压力小的工作呢，这样子的生活太难受了，已经超
过我的能力范围了 |
M*****n
发帖数: 16729 | |
p********o
发帖数: 29 | 5 还有没有得商量？你说你尽快做，态度好一点，自己说得可怜点？
质粒构建是可能很折腾人，不过建议你太难的就多花点钱用基因合成服务之类的(比如
GenScript)，几百bp的话也不是很贵，另外去看看NEB的Flash Phusion以及GenScript
的CloneEZ® PCR Cloning Kit,我以前做个，两个结合着用3个月内做了无数个很
难的亚克隆，成功率很高，希望能对你有用。
BTW: 哥们是复旦毕业的？ |
b*******6
发帖数: 39 | 6 谢谢！
方法应该行得通了，只是效率很低（几个克隆，不少突变），因为最后一次那8个构建
里面我已经出来一个了。
我还是赶紧找下家吧，找不到就回国，也挺好，反正自己也不是那种要求功成名就的人
，把自己的父母照顾好，平平安安生活也好。
最后一个问题见信件，我只是来发泄寻求安慰一下。
GenScript
【在 p********o 的大作中提到】
: 还有没有得商量？你说你尽快做，态度好一点，自己说得可怜点？
: 质粒构建是可能很折腾人，不过建议你太难的就多花点钱用基因合成服务之类的(比如
: GenScript)，几百bp的话也不是很贵，另外去看看NEB的Flash Phusion以及GenScript
: 的CloneEZ® PCR Cloning Kit,我以前做个，两个结合着用3个月内做了无数个很
: 难的亚克隆，成功率很高，希望能对你有用。
: BTW: 哥们是复旦毕业的？
|
I***a
发帖数: 13467 | 7 有些克隆是蛮难做，
同样的方法，
别的能出来，
有的就是反反复复出不来， |
I***a
发帖数: 13467 | 8 跟老板交流，
特别是大老板，
别去纠缠这些细节，
哪怕去夸夸奇谈都可以。 |
l*h
发帖数: 4124 | 9 第一个只是subcloning哎
80bp
【在 b*******6 的大作中提到】
: 我4个月前硕士毕业来德国
: 一个挺好的大学 拿的是老板给的奖学金 不是国家奖学金
: 老板是我们这行的大牛 说实话 人也不错
: 刚开始的课题1个是克隆，把一个蛋白加上不同的tag插到pQE8或者pQE60的载体里面去
: 载体选的位点是BamH1和Hind3，片段的酶切位点用的是Bgl2（因为片段里面有BamH1位
: 点）和Hind3，因为要在N段和C段加上10+aa大小的tag，所以一般引物都很长，50-80bp
: 本来想用pQE9而不是pQE8，但实验室里面没有9，BamH1和Hind3在8里面中间就隔了1个
: 碱基
: 第二个课题是用Dpn1酶构建不同的突变株
: 用pQE8的那个载体死活折腾不出来，前前后后大概4个月，另外2个倒是很顺利
|
b**********8
发帖数: 349 | 10 我跟楼主遇到过几乎完全一样的困境，不过我的克隆比你更简单，我很菜的，就是把一
个基因的启动子克隆到PGL3 basic的载体里，也是前前后后做了好几个月没结果，顶多
就是把目的片段连到TA上，可是从TA上切下来连到PGL3 basic上时始终长不出来。后来
老板发飙了，亲自动手做了一次，哇塞，成功了，跟着就被老板劈头盖脸地训了一顿，
说什么cloning is the most basic techniques in molecular biology,if you
cannot do this, you can quit this area.不过我老板还从来没有赶人的经历，顶多
就是骂骂，然后一直看你不爽。
momo楼主，和老板好好谈谈吧，或许他只是一时气话，你自己再想想办法，或者把你手
头的工作找实验室其他人帮你做做，克隆有时候就是个运气，一个人做不出来，换一个
人就能做出来，我后来还帮组里另外一个PhD做出了一个她长期搞不定的克隆，长出一
口恶气啊。 |
|
|
b*******6
发帖数: 39 | 11 谢谢你！
“cloning is the most basic techniques in molecular biology,if you
cannot do this, you can quit this area.”他也对我说过类似的话，不过可能另外
一个原因就是他说的没申请到基金；德国本身压力就比美国甚至中国小些，这边周末实
验室基本看不到人；只是我运气差了一些。前前后后不知道考虑了多少原因，最后一次
总算弄出一个来了，因为准备考试的原因，就没有再赶一次，后来考试过了，老板彪了
；本来我还跟他说考试题目很难的呢。
还有2个月，我再试一试，或者请别人试一试。生活不管多艰难，也会走下去。
【在 b**********8 的大作中提到】
: 我跟楼主遇到过几乎完全一样的困境，不过我的克隆比你更简单，我很菜的，就是把一
: 个基因的启动子克隆到PGL3 basic的载体里，也是前前后后做了好几个月没结果，顶多
: 就是把目的片段连到TA上，可是从TA上切下来连到PGL3 basic上时始终长不出来。后来
: 老板发飙了，亲自动手做了一次，哇塞，成功了，跟着就被老板劈头盖脸地训了一顿，
: 说什么cloning is the most basic techniques in molecular biology,if you
: cannot do this, you can quit this area.不过我老板还从来没有赶人的经历，顶多
: 就是骂骂，然后一直看你不爽。
: momo楼主，和老板好好谈谈吧，或许他只是一时气话，你自己再想想办法，或者把你手
: 头的工作找实验室其他人帮你做做，克隆有时候就是个运气，一个人做不出来，换一个
: 人就能做出来，我后来还帮组里另外一个PhD做出了一个她长期搞不定的克隆，长出一
|
B******w
发帖数: 1040 | 12 刚到一个实验室
遇到些问题，尤其是克隆方面的问题还是很正常的
我在德国读的博士
感觉普遍来说德国老板比美国老板好说话
你在找老板好好谈谈
同时让作克隆牛的同事帮你试试
说不定就能改变老板的觉得
祝 好运 |
n***w
发帖数: 2405 | 13 我有个project是我rotation的时候一直做到现在的，就是搞克隆表达蛋白的，出了好
多差错，到现在差不多有1年了。我还是没有搞定。我和老板说，不好意思浪费了这么
多钱和时间，老板说，没有关系，one thing about graduate students is that you
have to be patient。当时我听了可是稀里哗啦的感动。 |
n***w
发帖数: 2405 | 14 引物是不是太长了。。。我从来没有用过这么长的引物，你试过用overlap pcr吗？另
外，你dNTP加了多少，有时候dNTP
要是不够，发生突变的概率比较大。
祝lz好运！
lz这么短时间内，比我有成果多了～～
80bp
【在 b*******6 的大作中提到】
: 我4个月前硕士毕业来德国
: 一个挺好的大学 拿的是老板给的奖学金 不是国家奖学金
: 老板是我们这行的大牛 说实话 人也不错
: 刚开始的课题1个是克隆，把一个蛋白加上不同的tag插到pQE8或者pQE60的载体里面去
: 载体选的位点是BamH1和Hind3，片段的酶切位点用的是Bgl2（因为片段里面有BamH1位
: 点）和Hind3，因为要在N段和C段加上10+aa大小的tag，所以一般引物都很长，50-80bp
: 本来想用pQE9而不是pQE8，但实验室里面没有9，BamH1和Hind3在8里面中间就隔了1个
: 碱基
: 第二个课题是用Dpn1酶构建不同的突变株
: 用pQE8的那个载体死活折腾不出来，前前后后大概4个月，另外2个倒是很顺利
|
p****n
发帖数: 9263 | 15 不是说在德国这种活都是技术员帮学生干的吗
【在 B******w 的大作中提到】
: 刚到一个实验室
: 遇到些问题，尤其是克隆方面的问题还是很正常的
: 我在德国读的博士
: 感觉普遍来说德国老板比美国老板好说话
: 你在找老板好好谈谈
: 同时让作克隆牛的同事帮你试试
: 说不定就能改变老板的觉得
: 祝 好运
|
M*****n
发帖数: 16729 | 16 你老板对你很负责任，
他看到你的将来不是搞science这一块的。
所以现在就让你早点改行，不要耽误你的青春。
这样的老板还是很难找的。
【在 b*******6 的大作中提到】
: 谢谢你！
: “cloning is the most basic techniques in molecular biology,if you
: cannot do this, you can quit this area.”他也对我说过类似的话，不过可能另外
: 一个原因就是他说的没申请到基金；德国本身压力就比美国甚至中国小些，这边周末实
: 验室基本看不到人；只是我运气差了一些。前前后后不知道考虑了多少原因，最后一次
: 总算弄出一个来了，因为准备考试的原因，就没有再赶一次，后来考试过了，老板彪了
: ；本来我还跟他说考试题目很难的呢。
: 还有2个月，我再试一试，或者请别人试一试。生活不管多艰难，也会走下去。
|
m***f
发帖数: 1622 | 17 no, obvious you have a last chance
你老板是一时生气，一般学生出现做不出来东西的时候，老板都是会谅解的
但做学生的一定要注意：
失败了，究竟是怎么失败的，老板问你时，你回答要特别有条理
然后你打算怎么解决？－－你克隆不出来，为什么不请教周围的人呢
技术上？思路上？哪里出了问题
2个月你不但该全部重复出来，而且做的更多，老板也就满意了
【在 b*******6 的大作中提到】
: 但是这个是开始，课题必须要用到这些质粒
: 更关键的是，周围的人特别是我实验室的师兄（也是中国人）说老板其实很不错，所以
: 自己对自己就更感到失败了，本身本身克隆做不出来，我也很郁闷；而且他是我们这行
: 的大牛，也很喜欢做这行，但是现在自己丢失到这个机会，很苦闷，想在这行找其他实
: 验室都不太容易了，老板基本都很熟
: 当然安慰自己的说法可能是，老板说没申请到基金
: 现在关键的是要在这2个月以内找到下家，稍微可以安慰的是，就在那次谈话不久，他
: 告诉我已经通过研究生院考试可以注册了，所以可以在学校里面找到一个老板，而不是
: 去其他城市
: 但是自己觉得很累，还不如回国找个压力小的工作呢，这样子的生活太难受了，已经超
|
s****9
发帖数: 932 | 18 我前段时间也是有个简单的subclone做不出来，后来实验的technican上手２天就搞顶
了。
后来发现别人给我的viral vector本身就不对。
汗，我已经postdoc第二年了。
80bp
【在 b*******6 的大作中提到】
: 我4个月前硕士毕业来德国
: 一个挺好的大学 拿的是老板给的奖学金 不是国家奖学金
: 老板是我们这行的大牛 说实话 人也不错
: 刚开始的课题1个是克隆，把一个蛋白加上不同的tag插到pQE8或者pQE60的载体里面去
: 载体选的位点是BamH1和Hind3，片段的酶切位点用的是Bgl2（因为片段里面有BamH1位
: 点）和Hind3，因为要在N段和C段加上10+aa大小的tag，所以一般引物都很长，50-80bp
: 本来想用pQE9而不是pQE8，但实验室里面没有9，BamH1和Hind3在8里面中间就隔了1个
: 碱基
: 第二个课题是用Dpn1酶构建不同的突变株
: 用pQE8的那个载体死活折腾不出来，前前后后大概4个月，另外2个倒是很顺利
|
b*******6
发帖数: 39 | 19 不应该是引物的原因
我在另外一端即Hind3那一段也有很长的引物，但是基本上没看到出问题，应该是Bgl2
和BamH1酶切的问题。突变的原因应该也不是PCR引入的，因为其他段（即除了Bgl2段的
）其他基本没发现如此多缺失和突变现象。我觉得你碰到的老板太好了，竟然会那么说
；别人一直跟我说，2周之类做不出克隆会被赶出实验室，用了那么多试剂重复了那么
多回还在折腾克隆同样也会被赶出实验室。
我询问过周围的高年级学生，有的建议换载体、换引物（但是现在已经出来一个克隆了
，换载体引物什么的、而且要选到合适载体）。你说的overlap PCR我没用，是我经验
不足，不知道可以这样，我当初不应该使用如此长的引物的。引物长贵不说，PCR也不
容易，容易形成二聚体，我后来尝试同Touchdown PCR才解决这个问题的。
【在 n***w 的大作中提到】
: 引物是不是太长了。。。我从来没有用过这么长的引物，你试过用overlap pcr吗？另
: 外，你dNTP加了多少，有时候dNTP
: 要是不够，发生突变的概率比较大。
: 祝lz好运！
: lz这么短时间内，比我有成果多了～～
:
: 80bp
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b*******6
发帖数: 39 | 20 老板也这么对我说过，不过不是说我不适合搞这一块，而是说兴许到了其他地方会对我
是个好的开始。说得很对，就像半瓶水一样，只有半瓶水与还有半瓶水说法都是没问题
的。
【在 M*****n 的大作中提到】
: 你老板对你很负责任，
: 他看到你的将来不是搞science这一块的。
: 所以现在就让你早点改行，不要耽误你的青春。
: 这样的老板还是很难找的。
|
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M*****n
发帖数: 16729 | 21 你们这么幸福？有tech帮忙？
俺从来没有tech帮忙，做不出来的只能自己纳闷。
实验室的tech做不出来的PCR，倒是有时候俺帮他们做
【在 s****9 的大作中提到】
: 我前段时间也是有个简单的subclone做不出来，后来实验的technican上手２天就搞顶
: 了。
: 后来发现别人给我的viral vector本身就不对。
: 汗，我已经postdoc第二年了。
:
: 80bp
|
b*******6
发帖数: 39 | 22 应该不会了，我准备和他回报其他结果的时候，他说不用了，你把它写成在这边的实践
总结吧。可能都很失望吧。
【在 m***f 的大作中提到】
: no, obvious you have a last chance
: 你老板是一时生气，一般学生出现做不出来东西的时候，老板都是会谅解的
: 但做学生的一定要注意：
: 失败了，究竟是怎么失败的，老板问你时，你回答要特别有条理
: 然后你打算怎么解决？－－你克隆不出来，为什么不请教周围的人呢
: 技术上？思路上？哪里出了问题
: 2个月你不但该全部重复出来，而且做的更多，老板也就满意了
|
b*******6
发帖数: 39 | 23 技术员只会做一些很普遍支持，比如说配制大家都要用的的试剂，不会特别为你一个人
服务的。
【在 p****n 的大作中提到】
: 不是说在德国这种活都是技术员帮学生干的吗
|
M*****n
发帖数: 16729 | 24 老板怎么可能直接这么说你。如果直接这么说，你不是更伤心颓废了。
当然是说你适合到别处去，但是你想想看老板的本意是什么？如果竖子可教，他当然不
会让你走。
所以老板的意思就是说你不适合科研。
早点嫁人，早点改行才是正道。
树挪死，人挪活。
【在 b*******6 的大作中提到】
: 老板也这么对我说过，不过不是说我不适合搞这一块，而是说兴许到了其他地方会对我
: 是个好的开始。说得很对，就像半瓶水一样，只有半瓶水与还有半瓶水说法都是没问题
: 的。
|
b*******6
发帖数: 39 | 25 而且这边2个月是有原因的，德国放弃租房合同要提前几个月说的，要不然会拿不到押
金。所以我的很短的时间里面搞定以后的去处，是留在这个大学，还是留在德国，还是
回国。
【在 m***f 的大作中提到】
: no, obvious you have a last chance
: 你老板是一时生气，一般学生出现做不出来东西的时候，老板都是会谅解的
: 但做学生的一定要注意：
: 失败了，究竟是怎么失败的，老板问你时，你回答要特别有条理
: 然后你打算怎么解决？－－你克隆不出来，为什么不请教周围的人呢
: 技术上？思路上？哪里出了问题
: 2个月你不但该全部重复出来，而且做的更多，老板也就满意了
|
F*******2
发帖数: 103 | 26 克隆本来就是很tricky的，我曾经1个月内做不出1个克隆，也曾经3天内搞定4个克隆～
～ |
n********k
发帖数: 2818 | 27 BamH1和Hind3在8里面中间就隔了1个
u run into a difficult but rather common problem...how did u do your
digestion? Have your checked NEB
appendix about it---the correct one would be digest with HindIII first and
then digest with BamHI,
otherwise, your chance of success is very low...That said, I would always
try to avoid this situation...go with
different enzyme cute sites, fusion PCR, homologue based cloning, or blunt
ligation(nowaday very
easy)...For a beginner, I hope to remind one truth: virtually for any
cloning work, one would have a dozen or
more choices to achieve the same construction and thus one doesn't have to
stick to one design if it
repreatedly fails (not due to stupid mistakes or technique errors).
Not knowing the details of your work, conceivably I could come up with at
least a half dozen ways to
complete your construction...four months for routine construction is no
doubt a waste of time...that said, to
be fair it is rather common for a beginner and your boss is a bit too tough.
..PIs in general have much higher
tolerance threshold for students...anyway, if you still want to finish the
construction, you can either shoot
me a message or just post the detailed information and how you did, then I
am pretty sure that me or
someone here would be able to help you quite a bit...Of course, it would be
best if you have some very
experienced friends around who are willing to help you out...Sometimes, it
takes changing hands...but in
your case, I have a sense you started with a difficult design/strategy...
80bp |
r*****t
发帖数: 4793 | 28 孺子,孺子
竖子是骂人的
【在 M*****n 的大作中提到】
: 老板怎么可能直接这么说你。如果直接这么说，你不是更伤心颓废了。
: 当然是说你适合到别处去，但是你想想看老板的本意是什么？如果竖子可教，他当然不
: 会让你走。
: 所以老板的意思就是说你不适合科研。
: 早点嫁人，早点改行才是正道。
: 树挪死，人挪活。
|
s*********t
发帖数: 600 | 29 好人啊！！！！
楼主坚持一下下，挺过了这个难关就好了。
blunt
【在 n********k 的大作中提到】
: BamH1和Hind3在8里面中间就隔了1个
: u run into a difficult but rather common problem...how did u do your
: digestion? Have your checked NEB
: appendix about it---the correct one would be digest with HindIII first and
: then digest with BamHI,
: otherwise, your chance of success is very low...That said, I would always
: try to avoid this situation...go with
: different enzyme cute sites, fusion PCR, homologue based cloning, or blunt
: ligation(nowaday very
: easy)...For a beginner, I hope to remind one truth: virtually for any
|
y***i
发帖数: 11639 | 30 有可能是construct在细菌内leak expression，而表达的蛋白对细菌有毒，所以克隆
长不大，长大的都是变异克隆
可以尝试的是
1. 降低温度 30度培养
2. 看看板子上有没有很小的clone，挑出来，30度摇
3. 如果clone数不多，pcr check（只需要挑一点菌在pcr里沾一下）
4. 还不行尝试换其他菌种。
我也有一次怎么克隆都出不来，气得发疯。后来发现我是第一次遇到了蛋白毒性问题。
80bp
【在 b*******6 的大作中提到】
: 我4个月前硕士毕业来德国
: 一个挺好的大学 拿的是老板给的奖学金 不是国家奖学金
: 老板是我们这行的大牛 说实话 人也不错
: 刚开始的课题1个是克隆，把一个蛋白加上不同的tag插到pQE8或者pQE60的载体里面去
: 载体选的位点是BamH1和Hind3，片段的酶切位点用的是Bgl2（因为片段里面有BamH1位
: 点）和Hind3，因为要在N段和C段加上10+aa大小的tag，所以一般引物都很长，50-80bp
: 本来想用pQE9而不是pQE8，但实验室里面没有9，BamH1和Hind3在8里面中间就隔了1个
: 碱基
: 第二个课题是用Dpn1酶构建不同的突变株
: 用pQE8的那个载体死活折腾不出来，前前后后大概4个月，另外2个倒是很顺利
|
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|
p*******i
发帖数: 108 | 31 觉得4个月很正常吧，尤其lz刚刚开始。patpat，希望lz顺利度过难关。Lz不要因为这
种事情就觉得不适合干这行，自己要有信心啊。 |
W****C
发帖数: 1937 | 32 我老板说这个行业只有ｔｏｐ１０％的能生存， 所以你不用自卑。
都这样了， 我劝退， 别人不会扔砖头吧 |
p*****m
发帖数: 7030 | 33 大二的时候做实验 跟一个博士生（已经读了硕士又考博那种 按说做过很多实验了已经
）做克隆，花了大概1年时间做出俩construct，中间各种条件换了无数次，每次和老板
meet都是问酶切了多久放了多少载体之类的细小问题。。。当时我还以为所谓科学研究
就是这样的呢 Lol
【在 y***i 的大作中提到】
: 有可能是construct在细菌内leak expression，而表达的蛋白对细菌有毒，所以克隆
: 长不大，长大的都是变异克隆
: 可以尝试的是
: 1. 降低温度 30度培养
: 2. 看看板子上有没有很小的clone，挑出来，30度摇
: 3. 如果clone数不多，pcr check（只需要挑一点菌在pcr里沾一下）
: 4. 还不行尝试换其他菌种。
: 我也有一次怎么克隆都出不来，气得发疯。后来发现我是第一次遇到了蛋白毒性问题。
:
: 80bp
|
b*******6
发帖数: 39 | 34 谢谢你的详细意见。首先要说，我做分子克隆的经验不是很多。其次，基本不会不改变
条件反复重复。
1 当初选用pQE8也是没有办法，因为pQE9我们实验室没有（pQE8和9的区别就是8在酶切
位点之间只有一个碱基，而9要长得多）。最开始的时候没有意识如此近的酶切位点很
难切下来，最起码同时酶切不可能切下来。但是只尝试过一次顺序酶切不行就没有再尝
试用pQE8了，我不记得是先切BamH1还是Hind3，后面尝试插一段片段在2个酶切位点之
间再切。
2 用的内切酶是Fastdigest系列，据称内切时间很短，所以我们一般都只切3个小时，
像Bamh1也不能且很长时间，因为有信号活性，最开始还以为是Bamh1星号活性导致的。
3 后来就在pQE8的Hind3位点插进去了一段几百bp的片段，构建好的克隆载体，先用
Bamh1切（因为Hind3有2个），再用Hind3切，用Bamh1切可以看到质粒线性化，再用
Hind3切可以看到切下来的片段。所以质粒酶切应该没有问题。
4 关于PCR产物酶切。当初经验不足，只在引物两端加了3bp碱基而不是4bp，但是查了
酶切位点表，3bp对各个内切酶都已经足够了。但是依然没有克隆，后来延长了酶切时
间，过夜切，奇怪的事情发生了，可以看到酶切产物有2条带，很靠近，但是可以分开
（如果是没有切好的产物和切好的产物差别只有12bp左右，保护性碱基加上内切酶位点
）。后来将稍长的产物和稍短的产物（稍短产物是主要产物）都进行连接，连接产物进
行电泳，短产物加上质粒连接后有片段变动：就是那些连接后的产物比酶切的质粒要大
一些，差不多就是那些插入片段的大小。
5 前面还碰到的问题是载体自连对照板上很多克隆（差不多和目标板一样多，目标板里
面酶切了基本都是自连或者似乎是2倍片段大小），后来用碱性磷酸酶处理时间很长（
大于2小时）才使对照板克隆很少。
6 最后一次结果，终于对照板只有一个，目标板3-8个，挑出来鉴定大小不一，尽量选
些和预期大小一致的测序鉴定，结果前面已经讲了，除了一个正确外，基本上在Bgl2那
一段要么是突变，要么是缺失，最多的是缺失，缺失的情况也多样，只有一个是载体的
His段少掉的，其他都是缺失引物酶切段或者以后的序列，最长缺失几十bp。 |
M*****n
发帖数: 16729 | 35 像这样的project才是锻炼人才啊。如果undergrad对science 没有真正兴趣的，估计做
完这rotation以后，就可以改行了。
不过对于那个phd student 就是浪费青春了。
【在 p*****m 的大作中提到】
: 大二的时候做实验 跟一个博士生（已经读了硕士又考博那种 按说做过很多实验了已经
: ）做克隆，花了大概1年时间做出俩construct，中间各种条件换了无数次，每次和老板
: meet都是问酶切了多久放了多少载体之类的细小问题。。。当时我还以为所谓科学研究
: 就是这样的呢 Lol
|
M*****n
发帖数: 16729 | 36 俺给你出个主意吧。
要不你还是出钱outsource这个task吧。
找公司作200刀可以搞定。
【在 b*******6 的大作中提到】
: 谢谢你的详细意见。首先要说，我做分子克隆的经验不是很多。其次，基本不会不改变
: 条件反复重复。
: 1 当初选用pQE8也是没有办法，因为pQE9我们实验室没有（pQE8和9的区别就是8在酶切
: 位点之间只有一个碱基，而9要长得多）。最开始的时候没有意识如此近的酶切位点很
: 难切下来，最起码同时酶切不可能切下来。但是只尝试过一次顺序酶切不行就没有再尝
: 试用pQE8了，我不记得是先切BamH1还是Hind3，后面尝试插一段片段在2个酶切位点之
: 间再切。
: 2 用的内切酶是Fastdigest系列，据称内切时间很短，所以我们一般都只切3个小时，
: 像Bamh1也不能且很长时间，因为有信号活性，最开始还以为是Bamh1星号活性导致的。
: 3 后来就在pQE8的Hind3位点插进去了一段几百bp的片段，构建好的克隆载体，先用
|
X******n
发帖数: 914 | 37 建议你把所有的东西寄给Morphin同学给你做吧。 |
p*****m
发帖数: 7030 | 38 没有把。。我觉得对undergrad也是浪费青春。当时我刚开始做实验觉得很cool，还把
上的好好的经济双学位退掉了。现在想想就为了两个破construct？sigh
【在 M*****n 的大作中提到】
: 像这样的project才是锻炼人才啊。如果undergrad对science 没有真正兴趣的，估计做
: 完这rotation以后，就可以改行了。
: 不过对于那个phd student 就是浪费青春了。
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b*******6
发帖数: 39 | 39 具体步骤基本是这样的：
1 PCR 50-100 ul体系，所得产物跑胶后回收，所有产物均酶切（大概5ug，可能很多，
但是太少了最后会看不到；Fastdigest推荐protocol是切200ng 1ul酶，10min；所以开
始的时候切3个小时，因为当初质粒3个小时能切下来；后来过夜切，出现2个条带；PCR
产物比比质粒难切）；质粒一般切4ug，3个小时（BamH1切1小时，Hind31小时，碱性磷
酸酶1小时），或者在Bamh1灭活之后Hind3过夜切（BamH1据说明书超过1小时就有星号
活性）；酶切体系50ul，Fastdigest酶各1ul。所有酶切产物切胶回收，nanodrop定量。
2 连接50ng质粒，50ng片段（大小比是5：1，所以数量比大概是1：5），10ul体系，室
温1小时或者4度过夜。
3 转化：5ul产物加入到50-100ul感受态，冰浴30min，42度热激90s，冰浴2min，加入
800ul LB，37度30-45min，3500rpm 3min 离心，留100-200ul混匀细菌涂板。 |
M*****n
发帖数: 16729 | 40 在这种construct上面浪费功夫实在是不值。
如果俺是老板，俺早就找别人做了。没必要把Bigben 逼到死路上。
而且这种training不是scientist/phD training, 而是tech training.
【在 X******n 的大作中提到】
: 建议你把所有的东西寄给Morphin同学给你做吧。
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b*******6
发帖数: 39 | 41 谢谢，我好像有的时候注意到了小的透明的clone，但是也可能是幻觉。把做出来的pQE
60质粒表达，做WB发现，好像不诱导就有蛋白表达。
题。
【在 y***i 的大作中提到】
: 有可能是construct在细菌内leak expression，而表达的蛋白对细菌有毒，所以克隆
: 长不大，长大的都是变异克隆
: 可以尝试的是
: 1. 降低温度 30度培养
: 2. 看看板子上有没有很小的clone，挑出来，30度摇
: 3. 如果clone数不多，pcr check（只需要挑一点菌在pcr里沾一下）
: 4. 还不行尝试换其他菌种。
: 我也有一次怎么克隆都出不来，气得发疯。后来发现我是第一次遇到了蛋白毒性问题。
:
: 80bp
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O******e
发帖数: 4845 | 42 你要是修了经济双学位，现在说不定早就离开生物圈了。所以说啊，这两个破质粒
还是起了很大作用地。。。
【在 p*****m 的大作中提到】
: 没有把。。我觉得对undergrad也是浪费青春。当时我刚开始做实验觉得很cool，还把
: 上的好好的经济双学位退掉了。现在想想就为了两个破construct？sigh
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O******e
发帖数: 4845 | 43 不对吧。科学研究很重要的一部分就是实验技术啊。又不是做理论的。反正我是觉得
实验技能是基础，没有这个基础，根本做不了生物。
【在 M*****n 的大作中提到】
: 在这种construct上面浪费功夫实在是不值。
: 如果俺是老板，俺早就找别人做了。没必要把Bigben 逼到死路上。
: 而且这种training不是scientist/phD training, 而是tech training.
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n***w
发帖数: 2405 | 44 我赞同。
一开始都是frustration。
我做了一年也没做出个啥，老板到不急，我都急死了。现在想开了，等qualify完了再
说吧。
【在 O******e 的大作中提到】
: 不对吧。科学研究很重要的一部分就是实验技术啊。又不是做理论的。反正我是觉得
: 实验技能是基础，没有这个基础，根本做不了生物。
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f***4
发帖数: 886 | 45 我觉得还应该是引物的问题，你合成引物是用HLPC或PAGE纯化的吗？这么长的引物一般
的那个方法不行。你用的是MWG合成的引物吗？他家现在质量不可靠。
建议先放在TA载体上
Bgl2
【在 b*******6 的大作中提到】
: 不应该是引物的原因
: 我在另外一端即Hind3那一段也有很长的引物，但是基本上没看到出问题，应该是Bgl2
: 和BamH1酶切的问题。突变的原因应该也不是PCR引入的，因为其他段（即除了Bgl2段的
: ）其他基本没发现如此多缺失和突变现象。我觉得你碰到的老板太好了，竟然会那么说
: ；别人一直跟我说，2周之类做不出克隆会被赶出实验室，用了那么多试剂重复了那么
: 多回还在折腾克隆同样也会被赶出实验室。
: 我询问过周围的高年级学生，有的建议换载体、换引物（但是现在已经出来一个克隆了
: ，换载体引物什么的、而且要选到合适载体）。你说的overlap PCR我没用，是我经验
: 不足，不知道可以这样，我当初不应该使用如此长的引物的。引物长贵不说，PCR也不
: 容易，容易形成二聚体，我后来尝试同Touchdown PCR才解决这个问题的。
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b*******6
发帖数: 39 | 46 用的是HPSF纯化，是Eurofins公司合成的
主要全是Bgl2一段出现的问题，Hind3那边也有用很长引物，但是没有发现问题，所以
就没有怀疑引物问题
【在 f***4 的大作中提到】
: 我觉得还应该是引物的问题，你合成引物是用HLPC或PAGE纯化的吗？这么长的引物一般
: 的那个方法不行。你用的是MWG合成的引物吗？他家现在质量不可靠。
: 建议先放在TA载体上
:
: Bgl2
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n***w
发帖数: 2405 | 47 1个正确的克隆就够。
【在 b*******6 的大作中提到】
: 谢谢你的详细意见。首先要说，我做分子克隆的经验不是很多。其次，基本不会不改变
: 条件反复重复。
: 1 当初选用pQE8也是没有办法，因为pQE9我们实验室没有（pQE8和9的区别就是8在酶切
: 位点之间只有一个碱基，而9要长得多）。最开始的时候没有意识如此近的酶切位点很
: 难切下来，最起码同时酶切不可能切下来。但是只尝试过一次顺序酶切不行就没有再尝
: 试用pQE8了，我不记得是先切BamH1还是Hind3，后面尝试插一段片段在2个酶切位点之
: 间再切。
: 2 用的内切酶是Fastdigest系列，据称内切时间很短，所以我们一般都只切3个小时，
: 像Bamh1也不能且很长时间，因为有信号活性，最开始还以为是Bamh1星号活性导致的。
: 3 后来就在pQE8的Hind3位点插进去了一段几百bp的片段，构建好的克隆载体，先用
|
f***4
发帖数: 886 | 48 mwg就是eurofins 。他自己述说The HPSF purification leads to a guaranteed
purity of > 70%.
HPSF对于你这么长的引物是不好的。你不能说另一个引物好，来说明现在有问题的这一
个。
快换引物或者用T载体。
我在几年前被 mwg害过一次，好在我用的是T载体，10个克隆里有一个引物这段序列是
对的。
现在我们做genotyping的引物经常出问题。
他家就是便宜。
【在 b*******6 的大作中提到】
: 用的是HPSF纯化，是Eurofins公司合成的
: 主要全是Bgl2一段出现的问题，Hind3那边也有用很长引物，但是没有发现问题，所以
: 就没有怀疑引物问题
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f***4
发帖数: 886 | 49 BTW,如果真是引物 的问题，老板也不能埋怨你了，只能怪他们德国的产品次。
你还可以用HIND3的这段引物去测你的PCR产物，这样就知道BGLII附近的序列有没有问
题了
【在 f***4 的大作中提到】
: mwg就是eurofins 。他自己述说The HPSF purification leads to a guaranteed
: purity of > 70%.
: HPSF对于你这么长的引物是不好的。你不能说另一个引物好，来说明现在有问题的这一
: 个。
: 快换引物或者用T载体。
: 我在几年前被 mwg害过一次，好在我用的是T载体，10个克隆里有一个引物这段序列是
: 对的。
: 现在我们做genotyping的引物经常出问题。
: 他家就是便宜。
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c*******n
发帖数: 218 | 50 说句实话， 我觉得你老板不是东西，象这种技术活做不出来，不过是时间和经验的问
题，可以臭骂你一顿，然后帮帮你或找个人帮帮你看看问题出在哪里不就结了吗。立马
赶人，一点余地不留，真不是东西。别信你SB师兄的，你老板不是什么好鸟。
80bp
【在 b*******6 的大作中提到】
: 我4个月前硕士毕业来德国
: 一个挺好的大学 拿的是老板给的奖学金 不是国家奖学金
: 老板是我们这行的大牛 说实话 人也不错
: 刚开始的课题1个是克隆，把一个蛋白加上不同的tag插到pQE8或者pQE60的载体里面去
: 载体选的位点是BamH1和Hind3，片段的酶切位点用的是Bgl2（因为片段里面有BamH1位
: 点）和Hind3，因为要在N段和C段加上10+aa大小的tag，所以一般引物都很长，50-80bp
: 本来想用pQE9而不是pQE8，但实验室里面没有9，BamH1和Hind3在8里面中间就隔了1个
: 碱基
: 第二个课题是用Dpn1酶构建不同的突变株
: 用pQE8的那个载体死活折腾不出来，前前后后大概4个月，另外2个倒是很顺利
|
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b*******6
发帖数: 39 | 51 谢谢你的建议，我试一试。
【在 f***4 的大作中提到】
: BTW,如果真是引物 的问题，老板也不能埋怨你了，只能怪他们德国的产品次。
: 你还可以用HIND3的这段引物去测你的PCR产物，这样就知道BGLII附近的序列有没有问
: 题了
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X*******0
发帖数: 134 | 52 50-80bp的primer,你有没有考虑到这么大引物合成中的错误合成,不完全合成?有没有向
引物合成公司注明要求PAGE纯化?不注明的话公司默认是给你脱盐纯化,错误产物也混在
里面.你这么长的primer,里面可能有大比例的错误引物,必然杯具啊
80bp
【在 b*******6 的大作中提到】
: 我4个月前硕士毕业来德国
: 一个挺好的大学 拿的是老板给的奖学金 不是国家奖学金
: 老板是我们这行的大牛 说实话 人也不错
: 刚开始的课题1个是克隆，把一个蛋白加上不同的tag插到pQE8或者pQE60的载体里面去
: 载体选的位点是BamH1和Hind3，片段的酶切位点用的是Bgl2（因为片段里面有BamH1位
: 点）和Hind3，因为要在N段和C段加上10+aa大小的tag，所以一般引物都很长，50-80bp
: 本来想用pQE9而不是pQE8，但实验室里面没有9，BamH1和Hind3在8里面中间就隔了1个
: 碱基
: 第二个课题是用Dpn1酶构建不同的突变株
: 用pQE8的那个载体死活折腾不出来，前前后后大概4个月，另外2个倒是很顺利
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p****n
发帖数: 9263 | 53 nod, lz is student not postdoc
【在 c*******n 的大作中提到】
: 说句实话， 我觉得你老板不是东西，象这种技术活做不出来，不过是时间和经验的问
: 题，可以臭骂你一顿，然后帮帮你或找个人帮帮你看看问题出在哪里不就结了吗。立马
: 赶人，一点余地不留，真不是东西。别信你SB师兄的，你老板不是什么好鸟。
:
: 80bp
|
A**********0
发帖数: 6942 | 54 你的做法：连接50ng质粒，50ng片段（大小比是5：1，所以数量比大概是1：5），
10ul体系，室温1小时或者4度过夜。 转化：5ul产物加入到50-100ul感受态
我觉着太保守了。。。 不过，好多人都是这么一直做的。
你试试不要定量定的那么仔细，大概用500ng片段和100ng质粒做连接，
然后体系变成20ul做一次试试看。。。
PCR
量。
【在 b*******6 的大作中提到】
: 具体步骤基本是这样的：
: 1 PCR 50-100 ul体系，所得产物跑胶后回收，所有产物均酶切（大概5ug，可能很多，
: 但是太少了最后会看不到；Fastdigest推荐protocol是切200ng 1ul酶，10min；所以开
: 始的时候切3个小时，因为当初质粒3个小时能切下来；后来过夜切，出现2个条带；PCR
: 产物比比质粒难切）；质粒一般切4ug，3个小时（BamH1切1小时，Hind31小时，碱性磷
: 酸酶1小时），或者在Bamh1灭活之后Hind3过夜切（BamH1据说明书超过1小时就有星号
: 活性）；酶切体系50ul，Fastdigest酶各1ul。所有酶切产物切胶回收，nanodrop定量。
: 2 连接50ng质粒，50ng片段（大小比是5：1，所以数量比大概是1：5），10ul体系，室
: 温1小时或者4度过夜。
: 3 转化：5ul产物加入到50-100ul感受态，冰浴30min，42度热激90s，冰浴2min，加入
|
g***l
发帖数: 3142 | 55 塞翁失马，焉知非福
趁机跳出生物火坑，说不定将来你还要感谢你的奴隶主老板帮你下决心。
80bp
【在 b*******6 的大作中提到】
: 我4个月前硕士毕业来德国
: 一个挺好的大学 拿的是老板给的奖学金 不是国家奖学金
: 老板是我们这行的大牛 说实话 人也不错
: 刚开始的课题1个是克隆，把一个蛋白加上不同的tag插到pQE8或者pQE60的载体里面去
: 载体选的位点是BamH1和Hind3，片段的酶切位点用的是Bgl2（因为片段里面有BamH1位
: 点）和Hind3，因为要在N段和C段加上10+aa大小的tag，所以一般引物都很长，50-80bp
: 本来想用pQE9而不是pQE8，但实验室里面没有9，BamH1和Hind3在8里面中间就隔了1个
: 碱基
: 第二个课题是用Dpn1酶构建不同的突变株
: 用pQE8的那个载体死活折腾不出来，前前后后大概4个月，另外2个倒是很顺利
|
H****H
发帖数: 11039 | 56 不是很复杂的事情啊，折腾这么久真有点说不过去了。照你说的“BamH1和Hind3在8里
面中间就隔了1个碱基”，你这酶切就做不好，切开一个位点，另一个位点切割效率就
很低。许多酶需要“保护碱基”才能切得开呀！
以后别闷着头瞎做了，遇到麻烦多查查资料或者请教一下周围有经验的同事，也许很快
就发现问题了。 |
L*******r
发帖数: 8961 | |
y**********o
发帖数: 37 | 58 前面有人提到了你用的两个酶切位点在载体上只隔了一个碱基,这种情况下载体双酶切
效率是很低的.
另外不知道你想加什么Tag到你要表达的蛋白上?如果是常见的FLAG和Myc这些,可以用个
笨点的方法,clontech有很多带Tag的表达载体,先把cDNA插到这些载体上,然后再用另一
对引物PCR扩带有Tag的蛋白序列.如此一来就避开了你的引物过长这个问题.并且只需要
做最常规最简单的克隆,只是在载体和酶切位点的选择上需要多花点时间验证. |
s***o
发帖数: 1189 | 59 好好顶一下这个贴
【在 M*****n 的大作中提到】
: 你老板对你很负责任，
: 他看到你的将来不是搞science这一块的。
: 所以现在就让你早点改行，不要耽误你的青春。
: 这样的老板还是很难找的。
|
k******t
发帖数: 1498 | 60 克隆的事情就不好意思说了。
实验室rotation的学生两月内50+克隆干的风生水起。
不妨试试in fusion。那小子都是批量制造，从未fail的说。
80bp
【在 b*******6 的大作中提到】
: 我4个月前硕士毕业来德国
: 一个挺好的大学 拿的是老板给的奖学金 不是国家奖学金
: 老板是我们这行的大牛 说实话 人也不错
: 刚开始的课题1个是克隆，把一个蛋白加上不同的tag插到pQE8或者pQE60的载体里面去
: 载体选的位点是BamH1和Hind3，片段的酶切位点用的是Bgl2（因为片段里面有BamH1位
: 点）和Hind3，因为要在N段和C段加上10+aa大小的tag，所以一般引物都很长，50-80bp
: 本来想用pQE9而不是pQE8，但实验室里面没有9，BamH1和Hind3在8里面中间就隔了1个
: 碱基
: 第二个课题是用Dpn1酶构建不同的突变株
: 用pQE8的那个载体死活折腾不出来，前前后后大概4个月，另外2个倒是很顺利
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g*********5
发帖数: 2533 | 61 genscript CloneEZ PCR kit...这个真的这么好？
flash phusion 突变率如何？
以前我买过clonetech类似的产物结果没有做出来 。。
GenScript
【在 p********o 的大作中提到】
: 还有没有得商量？你说你尽快做，态度好一点，自己说得可怜点？
: 质粒构建是可能很折腾人，不过建议你太难的就多花点钱用基因合成服务之类的(比如
: GenScript)，几百bp的话也不是很贵，另外去看看NEB的Flash Phusion以及GenScript
: 的CloneEZ® PCR Cloning Kit,我以前做个，两个结合着用3个月内做了无数个很
: 难的亚克隆，成功率很高，希望能对你有用。
: BTW: 哥们是复旦毕业的？
|
l*****o
发帖数: 26631 | 62 我的一点点经验是：克隆做不出来绝大多数都是酶切的问题。
有些载体不好连，可以先连到at连接的载体上。
这么长的引物我没做过，一般都连到有这个tag的载体里，再切下来再连。
【在 b*******6 的大作中提到】
: 谢谢你的详细意见。首先要说，我做分子克隆的经验不是很多。其次，基本不会不改变
: 条件反复重复。
: 1 当初选用pQE8也是没有办法，因为pQE9我们实验室没有（pQE8和9的区别就是8在酶切
: 位点之间只有一个碱基，而9要长得多）。最开始的时候没有意识如此近的酶切位点很
: 难切下来，最起码同时酶切不可能切下来。但是只尝试过一次顺序酶切不行就没有再尝
: 试用pQE8了，我不记得是先切BamH1还是Hind3，后面尝试插一段片段在2个酶切位点之
: 间再切。
: 2 用的内切酶是Fastdigest系列，据称内切时间很短，所以我们一般都只切3个小时，
: 像Bamh1也不能且很长时间，因为有信号活性，最开始还以为是Bamh1星号活性导致的。
: 3 后来就在pQE8的Hind3位点插进去了一段几百bp的片段，构建好的克隆载体，先用
|
r*****y
发帖数: 233 | 63 re!!
【在 l*****o 的大作中提到】
: 我的一点点经验是：克隆做不出来绝大多数都是酶切的问题。
: 有些载体不好连，可以先连到at连接的载体上。
: 这么长的引物我没做过，一般都连到有这个tag的载体里，再切下来再连。
|
t******u
发帖数: 3036 | |
w*******d
发帖数: 396 | 65 我觉得就是你的老板没有足够的经费，需要人离开实验室，而你刚好运气不好而已，和
你是否适合这个学科一点关系都没有。没有人可以会全部的技术。技术再好的人，也有
在简单试验上进度慢的时候。慢慢学就是了。科研本身就是一个学习的过程。先换个地
方也没什么不好的。 |
n********k
发帖数: 2818 | 66 仅有几
个克隆，送过去测序，要做的8个构建株里面只有一个对的，其他基本上都是在Bgl2那
一段的引物地方要么有突变要么就是缺失。
well, could you start with these wrong ones now and just do some mutagenesis
, like you did with dpn1 ones...it would be much easier if it were due to
digestion/ligation etc...but it won't solve the problem if your fragments
are toxic or have too many repeats etc...It is a bit strange that it only
happen to your primer region in all the constructions though...if it is
toxic or due to recombination, it could happen to any regions or the repeat
regions etc...please remember, there are so many alternatives to reach the
same Rome:))).one just has to be mindful and smart about it...
From your later responses, it seems you have done quite some home work/
exploration---have you reported in a very organized fashion what you have
done and how to approach the problems/trouble-shoot to him/her?, a
reasonable PI wouldn't only see the struggle without considering the
progression...When I have my own lab, I wouldn't kick out anyone just
because he/she fails but how/why he/she fails...
Nonetheless, could you elaborate more on what you are dealing with, the
goal of the experiments, the characteristics of your inserts(e.g: size,
repeats etc, or just post the sequences) and what exactly you did in term of
the experimental procedure, and exactly what reagents you have used...That
way, we might be able to help you in a concrete manner...
Unless you are dealing with some rare scenarios(but you have bumped into 7
of them, quite high incident, isn't it?), I couldn't believe cloning could
be that hard... My own experience with young folks including quite a few IDs
on this board tells me that most of times, the difficulties come with
either wrong strategies or technique problems or even human errors...some
are very simple ones...
BTW, if you are ok with it, send me all your sequence information and what
exactly you want, I won't mind spending some time to come up with several
strategies for you to try in parallel...I will for sure keep it confidential
if that's an issue...
我4个月前硕士毕业来德国
一个挺好的大学 拿的是老板给的奖学金 不是国家奖学金
老板是我们这行的大牛 说实话 人也不错
刚开始的课题1个是克隆，把一个蛋白加上不同的tag插到pQE8或者pQE60的载体里面去
载体选的位点是BamH1和Hind3，片段的酶切位点用的是Bgl2（因为片段里面有BamH1位
点）和Hind3，因为要在N段和C段加上10+aa大小的tag，所以一般引物都很长，50-80bp
本来想用pQE9而不是pQE8，但实验室里面没有9，BamH1和Hind3在8里面中间就隔了1个
碱基
第二个课题是用Dpn1酶构建不同的突变株
用pQE8的那个载体死活折腾不出来，前前后后大概4个月，另外2个倒是很顺利
第一次和老板谈活是在来这边3个月后，他说我是来读博士的，不应该在克隆这种小事
上折腾，应该很简单；第二次，就是昨天，他看到我pQE8最后一次克隆的结果：仅有几
个克隆，送过去测序，要做的8个构建株里面只有一个对的，其他基本上都是在Bgl2那
一段的引物地方要么有突变要么就是缺失。然后就发火了，叫我2个月以内结束实验室
课题走人。
来这边4个月，除了开始阶段适应外，基本上都在整这个克隆，想了好多的可能原因，
但是就一直没出来，自己心里也很郁闷。听有人说，如果到一个新的实验室，2周克隆
不出来，就会被赶走人；但是很郁闷，这个不管我怎么做，就是不出来；一次次看到光
秃秃的平板或者长满好多的对照板，就越觉得自己不该在这一行，自己的基础可能太差
了，这边除了实验汇报，生活基本是德语，交流又不多，所以生活也很郁闷。
看到周围那些同学不是旅游就是逛街，觉得人和人之间差距就是这么大。
生活就是一团糟糕，让人太难承受,上来抱怨一下。 |
n********k
发帖数: 2818 | 67 我好像有的时候注意到了小的透明的clone: you don't mean satellite clones, do
you?
pQE
【在 b*******6 的大作中提到】
: 谢谢，我好像有的时候注意到了小的透明的clone，但是也可能是幻觉。把做出来的pQE
: 60质粒表达，做WB发现，好像不诱导就有蛋白表达。
:
: 题。
|
n***w
发帖数: 2405 | 68 前辈真好。佩服。
下次我要是遇到问题了就找你。lol
mutagenesis
repeat
【在 n********k 的大作中提到】
: 仅有几
: 个克隆，送过去测序，要做的8个构建株里面只有一个对的，其他基本上都是在Bgl2那
: 一段的引物地方要么有突变要么就是缺失。
: well, could you start with these wrong ones now and just do some mutagenesis
: , like you did with dpn1 ones...it would be much easier if it were due to
: digestion/ligation etc...but it won't solve the problem if your fragments
: are toxic or have too many repeats etc...It is a bit strange that it only
: happen to your primer region in all the constructions though...if it is
: toxic or due to recombination, it could happen to any regions or the repeat
: regions etc...please remember, there are so many alternatives to reach the
|
g*****y
发帖数: 6325 | 69 引物的设计很重要。 GCcontent, hairpin, self-dimer这些都要考虑到。
Bgl2
【在 b*******6 的大作中提到】
: 不应该是引物的原因
: 我在另外一端即Hind3那一段也有很长的引物，但是基本上没看到出问题，应该是Bgl2
: 和BamH1酶切的问题。突变的原因应该也不是PCR引入的，因为其他段（即除了Bgl2段的
: ）其他基本没发现如此多缺失和突变现象。我觉得你碰到的老板太好了，竟然会那么说
: ；别人一直跟我说，2周之类做不出克隆会被赶出实验室，用了那么多试剂重复了那么
: 多回还在折腾克隆同样也会被赶出实验室。
: 我询问过周围的高年级学生，有的建议换载体、换引物（但是现在已经出来一个克隆了
: ，换载体引物什么的、而且要选到合适载体）。你说的overlap PCR我没用，是我经验
: 不足，不知道可以这样，我当初不应该使用如此长的引物的。引物长贵不说，PCR也不
: 容易，容易形成二聚体，我后来尝试同Touchdown PCR才解决这个问题的。
|
n********k
发帖数: 2818 | 70 谢谢你的详细意见。首先要说，我做分子克隆的经验不是很多。其次，基本不会不改变
条件反复重复。
1 当初选用pQE8也是没有办法，因为pQE9我们实验室没有（pQE8和9的区别就是8在酶切
位点之间只有一个碱基，而9要长得多）。最开始的时候没有意识如此近的酶切位点很
难切下来，最起码同时酶切不可能切下来。但是只尝试过一次顺序酶切不行就没有再尝
试用pQE8了，我不记得是先切BamH1还是Hind3，后面尝试插一段片段在2个酶切位点之
间再切。
Nice alternative, shall solve the problem in this case...but I would just do
blunt ligation, nowadays, the fast ligation kits from different companies
such as Roche, takara, don't really care about whether it is sticky or blunt
ends, it works just as well...BTW, any one else in your lab doing cloning
around the same time, hopefully your reagents are all good...
2 用的内切酶是Fastdigest系列，据称内切时间很短，所以我们一般都只切3个小时，
像Bamh1也不能且很长时间，因为有信号活性，最开始还以为是Bamh1星号活性导致的。
Star activity in general is not that big concern, I used BamHI all the time
either hrs or ON, never had any problem with start activity...if I am not in
a rush, I typically let digest go ON since it is easy to do when u are
leaving for home...
3 后来就在pQE8的Hind3位点插进去了一段几百bp的片段，构建好的克隆载体，先用
Bamh1切（因为Hind3有2个），再用Hind3切，用Bamh1切可以看到质粒线性化，再用
Hind3切可以看到切下来的片段。所以质粒酶切应该没有问题。
4 关于PCR产物酶切。当初经验不足，只在引物两端加了3bp碱基而不是4bp，但是查了
酶切位点表，3bp对各个内切酶都已经足够了。但是依然没有克隆，后来延长了酶切时
间，过夜切，奇怪的事情发生了，可以看到酶切产物有2条带，很靠近，但是可以分开
（如果是没有切好的产物和切好的产物差别只有12bp左右，保护性碱基加上内切酶位点
）。后来将稍长的产物和稍短的产物（稍短产物是主要产物）都进行连接，连接产物进
行电泳，短产物加上质粒连接后有片段变动：就是那些连接后的产物比酶切的质粒要大
一些，差不多就是那些插入片段的大小。
sometimes detour is short-cut, for PCR product digestion, if ever I run into
problem with cloning, I would go with a detour right way(in fact, I
typically do them in parallel), do a TA like cloning(I prefer to use
strategene's blunt end PCR cloning kit, very efficient, even with big insert
(>3-5kb which TA cloning doesn;t do well with)
5 前面还碰到的问题是载体自连对照板上很多克隆（差不多和目标板一样多，目标板里
面酶切了基本都是自连或者似乎是2倍片段大小），后来用碱性磷酸酶处理时间很长（
大于2小时）才使对照板克隆很少。
I always dep my vector, even with two sticky ends cloning/or blue/white
selection...my typical positive rate is above 50%(most of time >80-90%) even
with harder cloning...use Anartic AP not the usual AP(resist to heat
inaction)...and I like to do a gel-recover step, otherwise the residue
activity could dep your insert, then your cloning efficiency would be very
low that sometimes only wield one show up...this is not in any manual but
happens a lot to new cloners including myself...
6 最后一次结果，终于对照板只有一个，目标板3-8个，挑出来鉴定大小不一，尽量选
些和预期大小一致的测序鉴定，结果前面已经讲了，除了一个正确外，基本上在Bgl2那
一段要么是突变，要么是缺失，最多的是缺失，缺失的情况也多样，只有一个是载体的
His段少掉的，其他都是缺失引物酶切段或者以后的序列，最长缺失几十bp。
Something is very wrong with your system and i kind of bet on the steps at
the PCR cut, and the dephos and then ligation now...so few colonies are not
a good sign unless in rare scenario or an experienced cloner try to avoid
too many colonies... |
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|
s****r
发帖数: 736 | 71 兄弟，别怪我说的不中听：
这事，在第一个月没做出来的时候，你就该停了。然后做详尽的trouble shooting.找
有经验的师兄寻求帮助和指导。你这反反复复的简单重复，根本不解决问题啊。
我刚开始读Phd的时候，也犯过很多的错。今天想来，最可怕的就是死做。我个人倒不
怕花时间，但是却常常做的时间太多，想的时间太少。缺少很好的实验设计，即使每天
都花了很多时间，那也只是一再重现失败的结果。事倍功半了。
我建议你多想想。仔细看protocol, 找师兄老板开诚布公的聊聊。Good Luck! |
a*****y
发帖数: 277 | 72 楼主，可否考虑：
设计一对点突变引物，把篇pQE8的bamhi和hindiii之间加入数个碱基，就好切了。因为
差一个碱基是比较难的。那样以后实验室要构建，也好些。
或者，你不是有一个篇pQE8中已经做好的克隆吗，就用那个作为你的载体，应该超级好
切了，切了以后回收大片段，非常easy的事情。反正你要测序，不怕是那个你已经做好
的克隆。如果那个做好的克隆和你要克隆的片段大小不一样就更好了，测序前做个酶切
跑个胶就好了。
最好是第二方案，马上可以动手。 |
a*****y
发帖数: 277 | 73 对不起，没看清楚你的原帖。似乎你把8个基因都构建到了pQE8里面，只是有突变？要
看看sequencing的结果是不是可靠阿。比如要看原图，要看引物离基因那一段是不是太
近，等等。如果是酶切位点有突变的话，做一个酶切如果还能切下来，很有可能是测序
的问题。如果是引物区有问题，要合成引物的公司把最初mass spec的结果发给你看，
看引物是不是正确。
主要是要学会分析结果，多跟实验室人品好点的人问问吧。 |
p********o
发帖数: 29 | 74 这个组合至少对于我而言很好用，而且对于5kb以下的克隆几乎100%的准确率
【在 g*********5 的大作中提到】
: genscript CloneEZ PCR kit...这个真的这么好？
: flash phusion 突变率如何？
: 以前我买过clonetech类似的产物结果没有做出来 。。
:
: GenScript
|
H*********8
发帖数: 323 | 75 1.你老板分子生物学烂,你做的过程有问题,他没法给你解决,一味怪你.
2.你为啥不找你师兄帮你呢,要我是你师兄,直接抽点时间,给你做了. 对于老鸟来说,这
个克隆2-3天就搞定,就这3天还大部分时间还在喝茶,看报纸.
3.你老板没钱了,你赶快跑路才是正道. |
b*******6
发帖数: 39 | 76 因为忙着找实验室，抱歉回复晚了。谢谢大家的帮助，特别是neverthink的耐心分析。
这件事情的或许起于实验设计，克隆路线的选择，引物的设计和载体的选择，引入了过
长引物，载体酶切位点过于靠近。再往前推一下，是因为自己过于相信自己，刚到一个
地方没有向周围人请教就把引物发出去了。虽然和一个高年级博士讨论过，但是没有和
老板讨论。
和老板及周围高年资同学缺乏有效的交流是最主要的原因。4个月大概只和老板交流了4
-5次，不和老板交流的原因最主要是觉得这么简单的事情没做出来，太丢人了，做出来
再和老板沟通。其实我到丁香园上翻了好多克隆失败分析的帖子，也尝试改进方法，如
加入一段片段在两个内切酶位点间。但是问题的关键是我没有向周围老板可以信任的人
或者老板询问改进方法，我的一些尝试没有得到他的认可（事实也说明只有在在内切酶
位点间插入片段是可行的，其他还有不少尝试我没说出来，比如说是否用碱性磷酸酶处
理、酶切时间长短、片段与质粒比例、连接酶连接时间长短、次序酶切与双酶切），他
是对的，博士生不是来改进技术的或者闭门造车的。几个月只做出几个克隆是一般人难
以接受的。
有一个可能也是存在的，如果是我过程当中同时存在2个问题（wrong strategies or
technique problems or even human errors），那我怎么试也不会有结果，最简单的
就是向他人求助请他们帮忙，我没有，直至耗尽老板耐心。给我的奖学金是存在3个月
试用期，所以赶人是有理由的。
对我影响最大的问题是我是否适合与继续这个从事行业。我投入这个行业最大的动力是
医源性驱动，我在医院实习的时候看到病人因为目前我所从事的疾病痛苦，也体会到了
医生让病人恢复健康的那种满足感与所受的尊敬，你可以说我有多幼稚，但我确实是这
么想的。我们老板是这行的老大，所以我得跳出这个具体领域到更广泛的地方寻找机会
。最后的选择是回国，但我也是可以接受，因为我和我妈妈讲这件事的时候，她只是说
，对我没有什么要求，只要生活开心就好了，只要我把回国的机票钱留着就好了。
写这么多是对大家的帮助的反馈，特别是neverthink，你能把你的邮箱发给我嘛。 |
b*******6
发帖数: 39 | 77 是的，这是这件事最主要的原因。
【在 s****r 的大作中提到】
: 兄弟，别怪我说的不中听：
: 这事，在第一个月没做出来的时候，你就该停了。然后做详尽的trouble shooting.找
: 有经验的师兄寻求帮助和指导。你这反反复复的简单重复，根本不解决问题啊。
: 我刚开始读Phd的时候，也犯过很多的错。今天想来，最可怕的就是死做。我个人倒不
: 怕花时间，但是却常常做的时间太多，想的时间太少。缺少很好的实验设计，即使每天
: 都花了很多时间，那也只是一再重现失败的结果。事倍功半了。
: 我建议你多想想。仔细看protocol, 找师兄老板开诚布公的聊聊。Good Luck!
|
b*******6
发帖数: 39 | 78 这是实验室的原因，老板说到了他没有申请到经费。
【在 w*******d 的大作中提到】
: 我觉得就是你的老板没有足够的经费，需要人离开实验室，而你刚好运气不好而已，和
: 你是否适合这个学科一点关系都没有。没有人可以会全部的技术。技术再好的人，也有
: 在简单试验上进度慢的时候。慢慢学就是了。科研本身就是一个学习的过程。先换个地
: 方也没什么不好的。
|
b*******6
发帖数: 39 | 79 那个比较特别的地方是载体用的是Bamh1位点，片段用的是Bgl2位点，同尾酶，因为片
段里面有Bamh1位点。连接之后2个酶都没法切了，是个杂交位点。
【在 a*****y 的大作中提到】
: 对不起，没看清楚你的原帖。似乎你把8个基因都构建到了pQE8里面，只是有突变？要
: 看看sequencing的结果是不是可靠阿。比如要看原图，要看引物离基因那一段是不是太
: 近，等等。如果是酶切位点有突变的话，做一个酶切如果还能切下来，很有可能是测序
: 的问题。如果是引物区有问题，要合成引物的公司把最初mass spec的结果发给你看，
: 看引物是不是正确。
: 主要是要学会分析结果，多跟实验室人品好点的人问问吧。
|
b*******6
发帖数: 39 | 80 实验的目地是表达和纯化一个蛋白，加入不同的Translocation mitif，使它能够加到
培养基里面能够进入细胞内。
对于下面实验:
1 换引物、突变回去估计不太现实
2 因为出问题总是在Bamh1-Bgl2位点，而载体因为考虑Bamh1星号活性的问题只切了1小
时，所以考虑过夜切；还有考虑毒性问题，降低培养温度。质粒切以后跑胶的时候有一
个问题就是跑得不是很平直，不知道是因为我没有切好还是质粒量太多。
3 请别人做不是没考虑过，但是负责我的那位高年级博士生估计PCR都有问题，因为他
也做过，但是没做下去。长引物容易形成二聚体，我是用Touchdown PCR或者里面加了
甘油才解决问题的。
4 插入的片段很普通，就是600bp左右，关键是要加的tag，3个不同tag，是
translocation motif，加在蛋白上面用于进到细胞里面去的:
TLM 1 (PLSSIFSRIGDP, 12 aa)
CCGCTGAGCAGCATTTTTAGCCGCATTGGCGATCCG
TLM TAT (GRKKRRQRRRPPQ, 13 aa)
GGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGACCTCCTCAA
Penetratin (RQIKIWFQNRRMKWKK, 16 aa)
AGACAAATTAAAATATGGTTTCAAAATAGAAGGATGAAATGGAAGAAA
5 关于低级错误可能性的问题，不是没有，但是那个pQE60的克隆很快就做出来了，克
隆很多。区别在与pQE8位点很靠近，pQE8用了同尾酶，pQE8有BamH1（质粒只切了1小时
），pQE60引物不长。
6 因为实验室基本手段就是双酶切-连接，没看到TA连接或者其他克隆手段，明天去翻
一翻。 |
|
|
n***w
发帖数: 2405 | 81 和我做的很像。
其实换引物还是来得及的，因为在你条件都摸好的情况下，2－3天就能做好一个克隆。
关于质粒跑胶不平直，你是指什么样子的？ |
g*********5
发帖数: 2533 | 82 敬礼。你的学生肯定很幸福。
mutagenesis
repeat
【在 n********k 的大作中提到】
: 仅有几
: 个克隆，送过去测序，要做的8个构建株里面只有一个对的，其他基本上都是在Bgl2那
: 一段的引物地方要么有突变要么就是缺失。
: well, could you start with these wrong ones now and just do some mutagenesis
: , like you did with dpn1 ones...it would be much easier if it were due to
: digestion/ligation etc...but it won't solve the problem if your fragments
: are toxic or have too many repeats etc...It is a bit strange that it only
: happen to your primer region in all the constructions though...if it is
: toxic or due to recombination, it could happen to any regions or the repeat
: regions etc...please remember, there are so many alternatives to reach the
|
g*********5
发帖数: 2533 | 83 最常见的理由。但不一定是真的，这样大家面子都好看。
【在 b*******6 的大作中提到】
: 这是实验室的原因，老板说到了他没有申请到经费。
|
f****n
发帖数: 67 | 84 我做过pQE70，也是bamh1和hind3之间有1个bp，很难同时切开的，需要有保护碱基的，
hind3需要的保护比bamh1多，建议先切hind3，然后加bamh1，再q切，下面是NEB的关于
保护碱基的链接
http://www.neb.com/nebecomm/tech_reference/restriction_enzymes/ |
f****n
发帖数: 67 | 85 我做过pQE70，也是bamh1和hind3之间有1个bp，很难同时切开的，需要有保护碱基的，
hind3需要的保护比bamh1多，建议先切hind3，然后加bamh1，再q切，下面是NEB的关于
保护碱基的链接
http://www.neb.com/nebecomm/tech_reference/restriction_enzymes/ |
y***i
发帖数: 11639 | 86 定一对probe改造一下就可以了。
比如 pQE70酶切位点是 EcoRI-BamH1-Hind3. 你可以定一组probe，anneal后两边分
别是EcoRI 和 Hind3的位点，中间有BamH1但是和HindIII用4 5个bp隔开。然后把
construct用EcoRI 和 Hind3酶切--连接，以后用就很方便。
【在 f****n 的大作中提到】
: 我做过pQE70，也是bamh1和hind3之间有1个bp，很难同时切开的，需要有保护碱基的，
: hind3需要的保护比bamh1多，建议先切hind3，然后加bamh1，再q切，下面是NEB的关于
: 保护碱基的链接
: http://www.neb.com/nebecomm/tech_reference/restriction_enzymes/
|
l*****o
发帖数: 26631 | 87 和你实验室的其他人交流是很重要的...
比如你们用的都是同一个公司的酶，别人怎么用, 设计多长保护位点，切多久，这些条
件应该是他们都摸好的。你都可以直接照着做。
而且很多时候理论上有很多地方都可能出问题，但是做的多的人都知道哪些地方最容易
出问题。
再说你本来就是去学习的，怎么还在乎这种莫名其妙的面子，多和别人，甚至别的实验
室的人多聊聊呀，比自己瞎琢磨三个月要好多了...
【在 b*******6 的大作中提到】
: 实验的目地是表达和纯化一个蛋白，加入不同的Translocation mitif，使它能够加到
: 培养基里面能够进入细胞内。
: 对于下面实验:
: 1 换引物、突变回去估计不太现实
: 2 因为出问题总是在Bamh1-Bgl2位点，而载体因为考虑Bamh1星号活性的问题只切了1小
: 时，所以考虑过夜切；还有考虑毒性问题，降低培养温度。质粒切以后跑胶的时候有一
: 个问题就是跑得不是很平直，不知道是因为我没有切好还是质粒量太多。
: 3 请别人做不是没考虑过，但是负责我的那位高年级博士生估计PCR都有问题，因为他
: 也做过，但是没做下去。长引物容易形成二聚体，我是用Touchdown PCR或者里面加了
: 甘油才解决问题的。
|
z*t
发帖数: 863 | 88 exactly, I once struggled with a clone for 2 months simplely due to the
expirate enzymes --|| , so I got to change the primers time to time to
provide the new restrciction site to test the effect of enzymes....and the
purchase of primer is limitted in our lab...
mutagenesis
repeat
【在 n********k 的大作中提到】
: 仅有几
: 个克隆，送过去测序，要做的8个构建株里面只有一个对的，其他基本上都是在Bgl2那
: 一段的引物地方要么有突变要么就是缺失。
: well, could you start with these wrong ones now and just do some mutagenesis
: , like you did with dpn1 ones...it would be much easier if it were due to
: digestion/ligation etc...but it won't solve the problem if your fragments
: are toxic or have too many repeats etc...It is a bit strange that it only
: happen to your primer region in all the constructions though...if it is
: toxic or due to recombination, it could happen to any regions or the repeat
: regions etc...please remember, there are so many alternatives to reach the
|
s**********e
发帖数: 2888 | 89 建议你还是赶紧找下家，因为觉得你老板的人品不怎样，这个是非常关键的。即使现在
的实验做好了，以后再有问题（以后总有问题的，实验就是这样），老板又唧唧崴崴，
还不痛苦死？才两个月，一切都还早。
我至今觉得我读博士的时候做的最正确的一件事情就是换了老板。你可以在本校的里面
发信问一下，看有没有别的老板，这样比较简单。 |
M*****n
发帖数: 16729 | 90 看完之后，总结一下：bigben 同学是个刻苦勤奋的好同学，
what she lacks is guidance. |
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z*t
发帖数: 863 | 91 您不劝退了? :)
【在 M*****n 的大作中提到】
: 看完之后，总结一下：bigben 同学是个刻苦勤奋的好同学，
: what she lacks is guidance.
|
M*****n
发帖数: 16729 | 92 俺负责任地劝过了
不过bigben同学比较坚定。
只能wish her good luck了。
【在 z*t 的大作中提到】
: 您不劝退了? :)
|
y**********o
发帖数: 37 | 93 如果是我,我会选择直接合成这三个peptides的cDNA序列,两边留好酶切位点A和B,普通
PCR扩你的那600bp片段,两边加上酶切位点B和C,载体用酶A和C去切.这样三个不同的酶
切两个插入片段和一个载体,应该不难做连接.不过首先要解决你的载体问题,你选的两
个酶切位点那么近,运气好的话重复5次以上可能会得到一个克隆.
【在 b*******6 的大作中提到】
: 实验的目地是表达和纯化一个蛋白，加入不同的Translocation mitif，使它能够加到
: 培养基里面能够进入细胞内。
: 对于下面实验:
: 1 换引物、突变回去估计不太现实
: 2 因为出问题总是在Bamh1-Bgl2位点，而载体因为考虑Bamh1星号活性的问题只切了1小
: 时，所以考虑过夜切；还有考虑毒性问题，降低培养温度。质粒切以后跑胶的时候有一
: 个问题就是跑得不是很平直，不知道是因为我没有切好还是质粒量太多。
: 3 请别人做不是没考虑过，但是负责我的那位高年级博士生估计PCR都有问题，因为他
: 也做过，但是没做下去。长引物容易形成二聚体，我是用Touchdown PCR或者里面加了
: 甘油才解决问题的。
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M*****n
发帖数: 16729 | 94 you sounds like from a rich lab.
【在 y**********o 的大作中提到】
: 如果是我,我会选择直接合成这三个peptides的cDNA序列,两边留好酶切位点A和B,普通
: PCR扩你的那600bp片段,两边加上酶切位点B和C,载体用酶A和C去切.这样三个不同的酶
: 切两个插入片段和一个载体,应该不难做连接.不过首先要解决你的载体问题,你选的两
: 个酶切位点那么近,运气好的话重复5次以上可能会得到一个克隆.
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y**********o
发帖数: 37 | 95 不好意思,忘了考虑价格成本了.不过按LZ所描述的,似乎时间成本代价更大.这里怎么取
舍还是需要LZ自己去做决定.
you sounds like......好象有语法错误啊!
【在 M*****n 的大作中提到】
: you sounds like from a rich lab.
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p****n
发帖数: 9263 | 96 他只是碰上一个傻逼导师而已，不说明他不适合做生物
【在 M*****n 的大作中提到】
: 俺负责任地劝过了
: 不过bigben同学比较坚定。
: 只能wish her good luck了。
|
s******r
发帖数: 2876 | 97 这是命不好，一命二运三风水，
没有运气也不行。
他只是碰上一个傻逼导师而已，不说明他不适合做生物
【在 p****n 的大作中提到】
: 他只是碰上一个傻逼导师而已，不说明他不适合做生物
|
z*t
发帖数: 863 | 98 估计是气理不顺，想把这口气争回来。Anyway, best regards on bigben:)
【在 M*****n 的大作中提到】
: 俺负责任地劝过了
: 不过bigben同学比较坚定。
: 只能wish her good luck了。
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b*******6
发帖数: 39 | 99 平直就是一条直线，很直很直的
不平直，虽然都在一个位置，但总感觉有些歪扭
就像图示里面的右边条带一样
【在 n***w 的大作中提到】
: 和我做的很像。
: 其实换引物还是来得及的，因为在你条件都摸好的情况下，2－3天就能做好一个克隆。
: 关于质粒跑胶不平直，你是指什么样子的？
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b*******6
发帖数: 39 | 100 也不是完全瞎琢磨，引物合成之前，引物设计、载体选择、实验路线都和相关课题的博
士生讨论过了，只是出现问题之后我变更的速度不快，耗了太多时间。
【在 l*****o 的大作中提到】
: 和你实验室的其他人交流是很重要的...
: 比如你们用的都是同一个公司的酶，别人怎么用, 设计多长保护位点，切多久，这些条
: 件应该是他们都摸好的。你都可以直接照着做。
: 而且很多时候理论上有很多地方都可能出问题，但是做的多的人都知道哪些地方最容易
: 出问题。
: 再说你本来就是去学习的，怎么还在乎这种莫名其妙的面子，多和别人，甚至别的实验
: 室的人多聊聊呀，比自己瞎琢磨三个月要好多了...
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W****C
发帖数: 1937 | 101
ｓｍｅａｒ？
【在 b*******6 的大作中提到】
: 平直就是一条直线，很直很直的
: 不平直，虽然都在一个位置，但总感觉有些歪扭
: 就像图示里面的右边条带一样
|
b*******6
发帖数: 39 | 102 pQE703个酶切位点间好像有好多碱基，但是不管这个。你是说这样改造吗？
【在 y***i 的大作中提到】
: 定一对probe改造一下就可以了。
: 比如 pQE70酶切位点是 EcoRI-BamH1-Hind3. 你可以定一组probe，anneal后两边分
: 别是EcoRI 和 Hind3的位点，中间有BamH1但是和HindIII用4 5个bp隔开。然后把
: construct用EcoRI 和 Hind3酶切--连接，以后用就很方便。
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s********n
发帖数: 2939 | 103 说句实话，感觉如果你是和其他人讨论了这么多后还设计这么长的引物作PCR说明那些
人一点都没上心。
【在 b*******6 的大作中提到】
: 也不是完全瞎琢磨，引物合成之前，引物设计、载体选择、实验路线都和相关课题的博
: 士生讨论过了，只是出现问题之后我变更的速度不快，耗了太多时间。
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s********n
发帖数: 2939 | 104 不是很了解来龙去脉，你是没有带有不同tags的载体么？这样做克隆效率当然会很低啊。
如果你下一次做类似的课题，我建议你用Gateway cloning system，只需要将你的基因
克隆到pENTR vector（RE cloning，LIC cloning, TOPO cloning or BR
recombination），然后你就可以随意的将你的基因克隆到其他带有不同tag的pDEST
vectors上了，效率很高。
其他的还有ligation independent cloning (T4 DNAPol)和In-fusion cloning。 |
