W*********n
发帖数: 775 | 1 PCR扩增出一个基因的片断，1200bp, 电泳，胶回收，连接到TA载体上，然后转化感受
态细菌，却得不到白色菌斑，都是蓝色载体自连的。
可能原因：
1）胶回收试剂盒大约1年半前买的，并被断断续续用过，是否过旧？但是QG buffer的
颜色没有变化，感觉应该没有问题
2）后来检测了一下胶回收后的DNA片断浓度和质量，浓度为15ng/ul,0D260/280=1.73,
OD260/230=0.03； 感觉浓度还可以，260/280也行，但是为何260/230那么低呢？ 看图
发现230处吸收特别高。这是什么原因？用的电泳胶不好，还是胶回收的试剂盒有问题？
3）用的载体连接是invitrogen的TOPO TA cloning kit, 感受态细菌也是他家的Top
10F. 载体是08年底的，有三年多了，会不会是时间久了自连的比较多？
大家分析下，问题出在哪里？ 全都换掉有些浪费。 |
n********k
发帖数: 2818 | 2 1. u sure u are using correct polymerase?
2. I don't recall I would purify my PCR product with PCR-cloning kit..I
might have, just don't remember now...but would be a control for you if you
concern about that step...
3. Ditch TA-cloning kit from invitrogen, expensive and not that good, esp
with >3kb...I use blunt PCR cloning kit from strategen, half price and
double-performance, no problem with up to 5kb or more...and work well with
most of HF polymerases...
,
题？
【在 W*********n 的大作中提到】
: PCR扩增出一个基因的片断，1200bp, 电泳，胶回收，连接到TA载体上，然后转化感受
: 态细菌，却得不到白色菌斑，都是蓝色载体自连的。
: 可能原因：
: 1）胶回收试剂盒大约1年半前买的，并被断断续续用过，是否过旧？但是QG buffer的
: 颜色没有变化，感觉应该没有问题
: 2）后来检测了一下胶回收后的DNA片断浓度和质量，浓度为15ng/ul,0D260/280=1.73,
: OD260/230=0.03； 感觉浓度还可以，260/280也行，但是为何260/230那么低呢？ 看图
: 发现230处吸收特别高。这是什么原因？用的电泳胶不好，还是胶回收的试剂盒有问题？
: 3）用的载体连接是invitrogen的TOPO TA cloning kit, 感受态细菌也是他家的Top
: 10F. 载体是08年底的，有三年多了，会不会是时间久了自连的比较多？
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s******s
发帖数: 13035 | 3 从来不用蓝白斑，这个assay太烂，直接挑个8个colony PCR验证
,
题？
【在 W*********n 的大作中提到】
: PCR扩增出一个基因的片断，1200bp, 电泳，胶回收，连接到TA载体上，然后转化感受
: 态细菌，却得不到白色菌斑，都是蓝色载体自连的。
: 可能原因：
: 1）胶回收试剂盒大约1年半前买的，并被断断续续用过，是否过旧？但是QG buffer的
: 颜色没有变化，感觉应该没有问题
: 2）后来检测了一下胶回收后的DNA片断浓度和质量，浓度为15ng/ul,0D260/280=1.73,
: OD260/230=0.03； 感觉浓度还可以，260/280也行，但是为何260/230那么低呢？ 看图
: 发现230处吸收特别高。这是什么原因？用的电泳胶不好，还是胶回收的试剂盒有问题？
: 3）用的载体连接是invitrogen的TOPO TA cloning kit, 感受态细菌也是他家的Top
: 10F. 载体是08年底的，有三年多了，会不会是时间久了自连的比较多？
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n********k
发帖数: 2818 | 4 really? works well with me...that said, colony-PCR makes all easy...with 蓝
白斑 assay, my efficiency is typically 80% or above...
【在 s******s 的大作中提到】
: 从来不用蓝白斑，这个assay太烂，直接挑个8个colony PCR验证
:
: ,
: 题？
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l******g
发帖数: 1145 | 5 前段时间我也碰到相同的问题，全部是蓝菌，泪奔～
gel purification后的dna，260／230很低很正常，可能和残留试剂比较多有关。只要
dna浓度可以，不会影响后续步骤。
不过gel purification会导致TA overhang丢失，连接效率降低，可以试试pcr
purification后直接连。 |
W*********n
发帖数: 775 | 6 本来我也没有用蓝白斑，但是挑了10都是PCR都是阴性；然后挑了4个培养抽提质粒然后
酶切，仍然没有看到我的目的片断，就用蓝白斑法一看，全是篮板。
【在 s******s 的大作中提到】
: 从来不用蓝白斑，这个assay太烂，直接挑个8个colony PCR验证
:
: ,
: 题？
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s******s
发帖数: 13035 | 7 多p一点。另外，有时候gel purification column不太干净，浓度太低，
这种情况下，我一般再过一次minElute(以前推荐过)浓缩后连接
【在 W*********n 的大作中提到】
: 本来我也没有用蓝白斑，但是挑了10都是PCR都是阴性；然后挑了4个培养抽提质粒然后
: 酶切，仍然没有看到我的目的片断，就用蓝白斑法一看，全是篮板。
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W*********n
发帖数: 775 | 8 I use "AmpliTaq® Gold" DNA Polymerase from Roche , I think it should be
ok... Not very sure. How do you think?
you
【在 n********k 的大作中提到】
: 1. u sure u are using correct polymerase?
: 2. I don't recall I would purify my PCR product with PCR-cloning kit..I
: might have, just don't remember now...but would be a control for you if you
: concern about that step...
: 3. Ditch TA-cloning kit from invitrogen, expensive and not that good, esp
: with >3kb...I use blunt PCR cloning kit from strategen, half price and
: double-performance, no problem with up to 5kb or more...and work well with
: most of HF polymerases...
:
: ,
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W*********n
发帖数: 775 | 9 你是说收集到的ＤＮＡ溶液在上一次新的柱子？ 需要再用ＰＥ洗剂不？ 本来DNA浓
度不高，这么一弄是不是更少了？我一直用20ul来洗脱DNA.
【在 s******s 的大作中提到】
: 多p一点。另外，有时候gel purification column不太干净，浓度太低，
: 这种情况下，我一般再过一次minElute(以前推荐过)浓缩后连接
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s******s
发帖数: 13035 | 10 用50-100ul做最大洗脱，然后过一下minElute，用10ul洗脱浓缩。
这个和Qiagen的spin column一样的protocol, 唯一的区别是洗脱体积小
【在 W*********n 的大作中提到】
: 你是说收集到的ＤＮＡ溶液在上一次新的柱子？ 需要再用ＰＥ洗剂不？ 本来DNA浓
: 度不高，这么一弄是不是更少了？我一直用20ul来洗脱DNA.
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z*******o
发帖数: 1794 | 11 纯化后大部分A将丢失，不利于做TA克隆。可以将纯化产物加到Tag PCR反应体系中，唯
独不加primer，在72扩增30min加A，直接取这个产物做TA克隆。 |
W*********n
发帖数: 775 | 12 那样的话，dATP不会和DNA片断竞争 T载体上的T 么？ 您是否这么做过？刚才查了一个
加A反应和你说的一样：
高保真酶扩出的PCR产物，经胶回收试剂盒纯化回收PCR产物，再用Taq酶加A,其体系如
下：
Taq 酶 0.5ul
10XBuffer 1ul
dNTP 0.5ul
回收产物 8ul
再做72度20min进行加A反应，完成后不纯化，直接与T载体连接！转化后的菌落与平时
的差不多！
【在 z*******o 的大作中提到】
: 纯化后大部分A将丢失，不利于做TA克隆。可以将纯化产物加到Tag PCR反应体系中，唯
: 独不加primer，在72扩增30min加A，直接取这个产物做TA克隆。
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n********k
发帖数: 2818 | 13 Are you really a 老革命?:)))
【在 W*********n 的大作中提到】
: 那样的话，dATP不会和DNA片断竞争 T载体上的T 么？ 您是否这么做过？刚才查了一个
: 加A反应和你说的一样：
: 高保真酶扩出的PCR产物，经胶回收试剂盒纯化回收PCR产物，再用Taq酶加A,其体系如
: 下：
: Taq 酶 0.5ul
: 10XBuffer 1ul
: dNTP 0.5ul
: 回收产物 8ul
: 再做72度20min进行加A反应，完成后不纯化，直接与T载体连接！转化后的菌落与平时
: 的差不多！
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W*********n
发帖数: 775 | 14
【在 n********k 的大作中提到】
: Are you really a 老革命?:)))
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W*********n
发帖数: 775 | 15 以前在国内读博士的时候，经常克隆基因，然后插入载体测序，再插入表达载体作表达
；TA克隆作了不下百回了，但是很少遇到问题，觉得是很容易的操作。好久不做，现在
重新开始做，试验了几次，都没有结果，我觉得可能是不是哪个试剂盒有问题？
【在 n********k 的大作中提到】
: Are you really a 老革命?:)))
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W*********n
发帖数: 775 | 16 可能以前做得太顺利的，缺乏解决问题的能力，不像老革命。顺便问一下：您从哪里看
出幼稚来的？
【在 n********k 的大作中提到】
: Are you really a 老革命?:)))
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n********k
发帖数: 2818 | 17 Nothing much....from the one you asked about the reaction to adding 3'-A...
that's a very basic one for any experienced cloner...Anyway, trust me, ditch
TA-cloning kit if you still need to do lots of PCR-cloning...there are many
better ways to do cloning now...
【在 W*********n 的大作中提到】
: 可能以前做得太顺利的，缺乏解决问题的能力，不像老革命。顺便问一下：您从哪里看
: 出幼稚来的？
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C*******e
发帖数: 4348 | 18 同不喜欢TA cloning
都用Blunt PCR cloning
Strategen的blunt PCR cloning kit跟invitrogen的pTOPO-BluntII相比如何？
invitrogen真是很贵很抠门
尤其他们家的感受态细胞
越来越稀有木有
you
【在 n********k 的大作中提到】
: 1. u sure u are using correct polymerase?
: 2. I don't recall I would purify my PCR product with PCR-cloning kit..I
: might have, just don't remember now...but would be a control for you if you
: concern about that step...
: 3. Ditch TA-cloning kit from invitrogen, expensive and not that good, esp
: with >3kb...I use blunt PCR cloning kit from strategen, half price and
: double-performance, no problem with up to 5kb or more...and work well with
: most of HF polymerases...
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X******n
发帖数: 914 | |
j***w
发帖数: 938 | 20 我刚做过同样的实验，但有几点不同于你的：
1: 直接用PCR product 做克隆，因为我做过很多cut clean的回收测序，要损失很多产
物，并且不纯。
2：你回收后的DNA有问题，OD260/230 太低了，你可以测测你的回收前pcr的产物浓度
，看看是不是也一样。
3：同时做阳性对照，可以看出是不是kit出了问题。
希望对你又参考
,
题？
【在 W*********n 的大作中提到】
: PCR扩增出一个基因的片断，1200bp, 电泳，胶回收，连接到TA载体上，然后转化感受
: 态细菌，却得不到白色菌斑，都是蓝色载体自连的。
: 可能原因：
: 1）胶回收试剂盒大约1年半前买的，并被断断续续用过，是否过旧？但是QG buffer的
: 颜色没有变化，感觉应该没有问题
: 2）后来检测了一下胶回收后的DNA片断浓度和质量，浓度为15ng/ul,0D260/280=1.73,
: OD260/230=0.03； 感觉浓度还可以，260/280也行，但是为何260/230那么低呢？ 看图
: 发现230处吸收特别高。这是什么原因？用的电泳胶不好，还是胶回收的试剂盒有问题？
: 3）用的载体连接是invitrogen的TOPO TA cloning kit, 感受态细菌也是他家的Top
: 10F. 载体是08年底的，有三年多了，会不会是时间久了自连的比较多？
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b********c
发帖数: 161 | 21 08年的太老了.基本不能用了,我之前用08年的都是载体自连的.gel purify过后再30分
加上A容易成功. |
g*********5
发帖数: 2533 | 22 Try alpha select competent cell from BIOLINE.
Cheaper and high efficiency.
【在 C*******e 的大作中提到】
: 同不喜欢TA cloning
: 都用Blunt PCR cloning
: Strategen的blunt PCR cloning kit跟invitrogen的pTOPO-BluntII相比如何？
: invitrogen真是很贵很抠门
: 尤其他们家的感受态细胞
: 越来越稀有木有
:
: you
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C*******e
发帖数: 4348 | 23 好
【在 g*********5 的大作中提到】
: Try alpha select competent cell from BIOLINE.
: Cheaper and high efficiency.
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n********k
发帖数: 2818 | 24 Never work with invitrogen cloning kit since I used strategen ones...so no
idea about the comparison
BTW, to save, one could cut down the reaction volume to a half or even 1/4
with all the reagents, including the competent cells(20-25ul is very safe,
10-15ul is fine), so with the 20 reaction kit, I can get at least 40-80
reactions...there was time I need to do 20-50 cloning or something like that
in a week...
【在 C*******e 的大作中提到】
: 同不喜欢TA cloning
: 都用Blunt PCR cloning
: Strategen的blunt PCR cloning kit跟invitrogen的pTOPO-BluntII相比如何？
: invitrogen真是很贵很抠门
: 尤其他们家的感受态细胞
: 越来越稀有木有
:
: you
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C*******e
发帖数: 4348 | 25 多谢
刚才看到价格上的话strategen的便宜了快一半
下次试试
that
【在 n********k 的大作中提到】
: Never work with invitrogen cloning kit since I used strategen ones...so no
: idea about the comparison
: BTW, to save, one could cut down the reaction volume to a half or even 1/4
: with all the reagents, including the competent cells(20-25ul is very safe,
: 10-15ul is fine), so with the 20 reaction kit, I can get at least 40-80
: reactions...there was time I need to do 20-50 cloning or something like that
: in a week...
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c***x
发帖数: 1169 | 26 The key is to add poly A again after purification.
After do controls. |
x*****e
发帖数: 309 | 27 haha,dATP 会不会和片段竞争T，我想也许会，但是不用担心，T4连接酶不会作用在那
种 Vect-T=dATP结构上。 我做Cloning还算顺利，有2个经验供参考：
1.只要条带单一我都是用2倍体积乙醇沉淀回收DNA，吹干后10ul溶解（用kit怎么也得
30ul洗脱，而且跑胶什么的对3'-a 多少有些影响,当然有杂带还是得跑胶回收，最后大
体积洗脱后在用乙醇沉淀浓缩一下).
2.尽可能少的加Vector片段，用高效率的感受态细胞（XL1-blue: stratgene Cat.
200249, >10e8, 如neverthink所说20 ul一个反应就足够了）, 最后也许长出的clone 少，但是阳性率很高，蓝白斑我不用好多年了。
其实，纯粹克隆基因直接加酶切位点，克隆到载体上就行，无须TA克隆。trouble shooting很痛苦，以前有段日子做克隆不顺，后来通过做各种control，发现是新换的Golden View DNA染料的问题，那东西能和单链核酸结合！！！
ditch
many
【在 n********k 的大作中提到】
: Nothing much....from the one you asked about the reaction to adding 3'-A...
: that's a very basic one for any experienced cloner...Anyway, trust me, ditch
: TA-cloning kit if you still need to do lots of PCR-cloning...there are many
: better ways to do cloning now...
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u**********d
发帖数: 573 | 28 re
不过我想LZ最需要的是做个control实验排查原因
【在 b********c 的大作中提到】
: 08年的太老了.基本不能用了,我之前用08年的都是载体自连的.gel purify过后再30分
: 加上A容易成功.
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