y****d
发帖数: 46 | 1 Taq酶的特征之一是会在PCR之后在3'端加上polyA尾，这方便了作TA克隆，但是我现在
的实验不希望有这个polyA尾，是否什么办法把它去掉，变成和pfu类似的平末端？谢谢！
补充：实验必须用Taq酶，不能换成pfu或Phusion之类的酶。 |
s******y
发帖数: 28562 | 2 如果你只是想要个平端的话，可以直接用klenow fragment 来把它补齐。
如果根本不想要那个多余的A 的话可以在反应结束后用pfu 处理。
谢！
【在 y****d 的大作中提到】
: Taq酶的特征之一是会在PCR之后在3'端加上polyA尾，这方便了作TA克隆，但是我现在
: 的实验不希望有这个polyA尾，是否什么办法把它去掉，变成和pfu类似的平末端？谢谢！
: 补充：实验必须用Taq酶，不能换成pfu或Phusion之类的酶。
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y****d
发帖数: 46 | 3 是的，不想要polyA，只是到引物的末端就可以了。
能否详细说说pfu处理的条件？是否需要先把Taq酶除去？
有相关的文献或资料吗？感谢！ |
i***l
发帖数: 1656 | 4 frankly, this is kinda common sense
no protocol, but i would do:
clean up your pcr with any available kit, thrown in pfu +buffer; or else,
throw in klenow (NEB) directly into your pcr tube
【在 y****d 的大作中提到】
: 是的，不想要polyA，只是到引物的末端就可以了。
: 能否详细说说pfu处理的条件？是否需要先把Taq酶除去？
: 有相关的文献或资料吗？感谢！
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i**y
发帖数: 71 | 5 先搞清楚什么叫polyA
谢！
【在 y****d 的大作中提到】
: Taq酶的特征之一是会在PCR之后在3'端加上polyA尾，这方便了作TA克隆，但是我现在
: 的实验不希望有这个polyA尾，是否什么办法把它去掉，变成和pfu类似的平末端？谢谢！
: 补充：实验必须用Taq酶，不能换成pfu或Phusion之类的酶。
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g*********5
发帖数: 2533 | 6 only one A would be added on to PCR product.
and CloneJET PCR Cloning Kit have DNA Blunt enzyme. |
s********n
发帖数: 2939 | 7 记得Taq好像是加3'-A吧，klenow没办法补齐的吧?
【在 s******y 的大作中提到】
: 如果你只是想要个平端的话，可以直接用klenow fragment 来把它补齐。
: 如果根本不想要那个多余的A 的话可以在反应结束后用pfu 处理。
:
: 谢！
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s******y
发帖数: 28562 | 8 哦，还真是呢。
听你这么一说，我认真想了想，其实klenow反而是有一定的3'-5' exonuclease
活性的，其实也能去除3'-A
【在 s********n 的大作中提到】
: 记得Taq好像是加3'-A吧，klenow没办法补齐的吧?
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y****d
发帖数: 46 | 9 感谢大家的帮助和讨论，再多问两句：
1. 加入pfu后的反应温度应该是多少？室温，37度，还是72度比较好？
2. 大概需要反应多长时间？是否有办法确定反应完毕？
对这个领域不太熟，见笑了！ |
M*****n
发帖数: 16729 | 10 use T4 DNA polymerase without dNTP,
it will trim the overhang,
double-check manufacturter's manual, because I may have remembered it wrong. |
y****d
发帖数: 46 | 11 谢谢！查了一下说明，发现这些酶都是需要在dNTP存在来切除overhang的。如果没有
dNTP的情况下容易造成3'端的凹陷。 |
l**********1
发帖数: 5204 | 12 RE LZ:
pls try
Cassette-ligation downstream 3'RACE PCR
or Tail-PCR
Protocol:
看图说话
>
Amplification of FSTs by 3’-RACE
Total RNA was isolated using hot-phenol extraction
[27], from 20 ml cultures in 50 ml Falcon tubes on a rotating
wheel. Reverse transcription used the SuperScript
III First-Strand kit from Invitrogen in a DNA Engine
PCR machine (MJ research). Primer QT was mixed with
5 μg RNA, incubated at 65 °C for 5 min then cooled to
55 °C over 100 sec, after which the annealed mixture
was kept at 0 °C. The RT-mix was added and incubation
proceeded at 25 °C for 5 min, then 50 °C for 50 min.
After inactivation at 85 °C (5 min) and cooling to 0 °C,
RNAseH was added and left to degrade template RNA
for 20 min at 37 °C. The resulting cDNA was diluted
20-fold in TE buffer and kept at 4 °C.
Refeence:
Meslet-Cladière L, Vallon O. (2012)
A new method to identify flanking sequence tags in chlamydomonas using 3'-
RACE.
Plant Methods. 8: 21.
web link:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22735168
【在 y****d 的大作中提到】
: 谢谢！查了一下说明，发现这些酶都是需要在dNTP存在来切除overhang的。如果没有
: dNTP的情况下容易造成3'端的凹陷。
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f*******e
发帖数: 354 | 13 hehe，不要这么凶吗
【在 i**y 的大作中提到】
: 先搞清楚什么叫polyA
:
: 谢！
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