p*****r
发帖数: 64 | 1 最近正在用一个悬浮细胞做high-throughput drug screen.流程很简单,就是把细胞加
在384 plate上,加上药物,3天后收细胞,提RNA,转cDNA,再做qPCR. 但是现在发现收细胞
的时候,仪器在remove medium的时候吸走了很多的细胞,使每个孔细胞数目很不一致,这
样做出来的qPCR variation太大. 目前我用V bottom的plate养细胞,不知道大家有这方
面的经验没有,怎样才能避免第一步remove medium时尽量不影响细胞的数目? 有没有可
能不remove medium,就直接在培养基里直接加lysis buffer,拿到RNA呢? 多谢了 :) | a*****g
发帖数: 543 | 2 what do you use to extract the RNA? Curious...
Assuming the machine handling wasted 50% of cells(which is a lot), you would
only have one cycle difference, which is not ideal but not terrible.
Then you somehow normalize to a control, such as b-actin. Theoretically you
wouldn't have a problem....
【在 p*****r 的大作中提到】
: 最近正在用一个悬浮细胞做high-throughput drug screen.流程很简单,就是把细胞加
: 在384 plate上,加上药物,3天后收细胞,提RNA,转cDNA,再做qPCR. 但是现在发现收细胞
: 的时候,仪器在remove medium的时候吸走了很多的细胞,使每个孔细胞数目很不一致,这
: 样做出来的qPCR variation太大. 目前我用V bottom的plate养细胞,不知道大家有这方
: 面的经验没有,怎样才能避免第一步remove medium时尽量不影响细胞的数目? 有没有可
: 能不remove medium,就直接在培养基里直接加lysis buffer,拿到RNA呢? 多谢了 :)
| p*****r
发帖数: 64 | 3 ABI 有个kit可以提RNA,但要求先把medium 去掉.然后加lysis buffer,就可以拿到RNA.
这个remove medium的机器不仅会让我loss ~50% 的细胞,关键是让组内的各个孔里的细
胞数差别太大,这样拿到的CT 值和control比较,统计出来variation太大, 没统计学意
义.
would
you
【在 a*****g 的大作中提到】
: what do you use to extract the RNA? Curious...
: Assuming the machine handling wasted 50% of cells(which is a lot), you would
: only have one cycle difference, which is not ideal but not terrible.
: Then you somehow normalize to a control, such as b-actin. Theoretically you
: wouldn't have a problem....
| a*****g
发帖数: 543 | 4 what if you dump the media your self?
Maybe pooring over and blot with paper towel would help? Will the machine be
able to continue with that?
Call the tech of ABI to see if can skip the vaccum step....
adding lysis buffer doesn't sounds that hard even you do it mannually...
I still don't understand the variation problem....Your control gene shoud re
flect the number of cells in that reaction, right? Unless your gene of inter
est is at the borderline of detection and too little material will mak
【在 p*****r 的大作中提到】
: ABI 有个kit可以提RNA,但要求先把medium 去掉.然后加lysis buffer,就可以拿到RNA.
: 这个remove medium的机器不仅会让我loss ~50% 的细胞,关键是让组内的各个孔里的细
: 胞数差别太大,这样拿到的CT 值和control比较,统计出来variation太大, 没统计学意
: 义.
:
: would
: you
| A******y
发帖数: 2041 | 5 You are looking at delta-delta C(t) right? So what's the problem unless
your RNA concentration is off the linear range. A lab with money to do 384
plate RT-PCR plate screen...I wounder... | h*******o
发帖数: 4884 | 6 Spin down the plate before media removal? | p*****r
发帖数: 64 | 7 谢谢上面几位的建议. 我也试过用paper towels,但384板上不是每个孔都平均的去掉
medium,所以不行.而且每次靠手来控制力度的话,差异更大. ABI 基本上没什么建议.
如果加一个板子的话,靠人还行,要是加100个板子,根本不可能做到.
做high-throughput screen, 我现在的确是看delta-delta C(t) right, 理论上不担心
每个孔出来到值,但是在284板子上,要用32个positive control 和32个DMSO 做Z
fanctor分析.这样的话,positive control 和DMSO组内的差异必须很小才行.所以只有
组内每个孔细胞数基本一直才行.
还有就是用qPCR 做screen的确耗钱,但现在是花了钱,也不能保证稳定. 真是麻烦阿.
【在 p*****r 的大作中提到】
: 最近正在用一个悬浮细胞做high-throughput drug screen.流程很简单,就是把细胞加
: 在384 plate上,加上药物,3天后收细胞,提RNA,转cDNA,再做qPCR. 但是现在发现收细胞
: 的时候,仪器在remove medium的时候吸走了很多的细胞,使每个孔细胞数目很不一致,这
: 样做出来的qPCR variation太大. 目前我用V bottom的plate养细胞,不知道大家有这方
: 面的经验没有,怎样才能避免第一步remove medium时尽量不影响细胞的数目? 有没有可
: 能不remove medium,就直接在培养基里直接加lysis buffer,拿到RNA呢? 多谢了 :)
| a*****g
发帖数: 543 | 8 给你个笨办法。。。
这么有钱的lab十个人总有吧？等harvest的时候，一人分10个板子，multichanel（12）
pippet一人一把，remove same volume of medium
完事了请人喝beer...
对了这个cell 怎么plate的啊？ 是同一个robot plate的么？那个机器能不能用来吸取
一部分media啊？
【在 p*****r 的大作中提到】
: 谢谢上面几位的建议. 我也试过用paper towels,但384板上不是每个孔都平均的去掉
: medium,所以不行.而且每次靠手来控制力度的话,差异更大. ABI 基本上没什么建议.
: 如果加一个板子的话,靠人还行,要是加100个板子,根本不可能做到.
: 做high-throughput screen, 我现在的确是看delta-delta C(t) right, 理论上不担心
: 每个孔出来到值,但是在284板子上,要用32个positive control 和32个DMSO 做Z
: fanctor分析.这样的话,positive control 和DMSO组内的差异必须很小才行.所以只有
: 组内每个孔细胞数基本一直才行.
: 还有就是用qPCR 做screen的确耗钱,但现在是花了钱,也不能保证稳定. 真是麻烦阿.
| p*****r
发帖数: 64 | 9 多谢aishang这个办法阿.呵呵. 人倒是不缺,就是男女老少,每人力道可不一样.而且
multichannel pippet我可是试过,那可是真不准阿.
要是谁真帮我搞定了,别说beer,连茅台我都请了.呵呵
加细胞是机器加的,很快,也很准.但remove medium是用另外一台机器,接vaccum的,吸力
很大,很容易把细胞吸走. 所以最好的办法还是直接加个lysis buffer, 不用remove
medium,这样就可以避免variation了.
12）
【在 a*****g 的大作中提到】
: 给你个笨办法。。。
: 这么有钱的lab十个人总有吧？等harvest的时候，一人分10个板子，multichanel（12）
: pippet一人一把，remove same volume of medium
: 完事了请人喝beer...
: 对了这个cell 怎么plate的啊？ 是同一个robot plate的么？那个机器能不能用来吸取
: 一部分media啊？
| s********n
发帖数: 2939 | 10 我记得96孔板有一种是有滤筛的，一般情况下孔里的液体不会流出，只有在在下方加
vaccum吸才能去除，不知道有没有384孔的，如果有的话可以解决你的问题。 | | | p*****r
发帖数: 64 | 11 hei, smartkevin 我怎么把滤筛放到每个孔里呢? 用vaccum可以吸掉medium,细胞留在
孔里吗?如果这个可行的话,真是个good idea. 请问能帮我查查滤筛的cat#吗? 多谢了.
【在 s********n 的大作中提到】
: 我记得96孔板有一种是有滤筛的，一般情况下孔里的液体不会流出，只有在在下方加
: vaccum吸才能去除，不知道有没有384孔的，如果有的话可以解决你的问题。
| a*****g
发帖数: 543 | 12 看什么牌子的multichannel pippet了...带锁的那种。
或者弄了ThermoScientific的matrix系列，电动吸液，没有力道的问题。这是夸张的解
决办法......如果每个人的力道能贡献10%的误差，那这个pippet的分子实验还有什么可
信度？而10%的影响到你的qPCR里又能有多少区别？
你也不用去除所有的medium. 如果每个well培养的时候加了12ul,取出10ul总没有问题吧
？剩下的加入10ul lysis buffer(这时候算算剩下的培养基1ul 和2ul 对你的总volume
能有多大影响？）
还有一个办法，给tip头一剪刀，vacumm的力道能小很多。或者买wide bore tip
【在 p*****r 的大作中提到】
: 多谢aishang这个办法阿.呵呵. 人倒是不缺,就是男女老少,每人力道可不一样.而且
: multichannel pippet我可是试过,那可是真不准阿.
: 要是谁真帮我搞定了,别说beer,连茅台我都请了.呵呵
: 加细胞是机器加的,很快,也很准.但remove medium是用另外一台机器,接vaccum的,吸力
: 很大,很容易把细胞吸走. 所以最好的办法还是直接加个lysis buffer, 不用remove
: medium,这样就可以避免variation了.
:
: 12）
| A******y
发帖数: 2041 | 13 I don't know what kit you are using, but I know there is a kit that allow
you to run RT-PCR in high-throughput without really isolating RNA (I think
you are doing this right?) If it is, extra media just there to interfere
with the lysis buffer. You don't have to remove it all just enough to lyse
the cells. I know someone almost patented the whole cell one step RT-PCR
technique but didn't.
Look at how the kit works and see if it make sense to you. So you added the
lysis buffer and then the on | s********n
发帖数: 2939 | 14 我查了一下，96-well filter plates很多，但384-well的就比较少，比如这一款：
FiltrEX™ 384 Well Filter Plates with 0.45µm PVDF Membrane。我不
确定这一款filter plate能否hold住media很长时间，你可以打电话问问他们的技术支
持。
如果不行的话可以这样，先在原来的384孔板培养细胞，然后用robot pipette打散细胞
，transfer一定体积的culture到这种filter plates，再离心或者用vaccum去除media
，估计这样就可以得到比较consistent的结果。
祝你好运！
了.
【在 p*****r 的大作中提到】
: hei, smartkevin 我怎么把滤筛放到每个孔里呢? 用vaccum可以吸掉medium,细胞留在
: 孔里吗?如果这个可行的话,真是个good idea. 请问能帮我查查滤筛的cat#吗? 多谢了.
| y****i
发帖数: 2194 | 15 cell-to-ct kit at the broad?
【在 p*****r 的大作中提到】
: 谢谢上面几位的建议. 我也试过用paper towels,但384板上不是每个孔都平均的去掉
: medium,所以不行.而且每次靠手来控制力度的话,差异更大. ABI 基本上没什么建议.
: 如果加一个板子的话,靠人还行,要是加100个板子,根本不可能做到.
: 做high-throughput screen, 我现在的确是看delta-delta C(t) right, 理论上不担心
: 每个孔出来到值,但是在284板子上,要用32个positive control 和32个DMSO 做Z
: fanctor分析.这样的话,positive control 和DMSO组内的差异必须很小才行.所以只有
: 组内每个孔细胞数基本一直才行.
: 还有就是用qPCR 做screen的确耗钱,但现在是花了钱,也不能保证稳定. 真是麻烦阿.
| p*****r
发帖数: 64 | 16 多谢大家的建议.
aishang,我目前就想用机器先remove大部分的medium,剩下约8ul的medium (如果剩下的
medium太少的话,机器的tip头就会很容易带走细胞),然后多加一些lysis buffer.虽然
这样lysis buffer被稀释了,但可以试试能不能拿到足够的RNA.
ArtyArty: 我目前用的是Cell to CT kit, 它提供lysis buffer, stop buffer,裂解细
胞后,可以拿到RNA, 然后RT 后拿到cDNA.你能不能告诉我你知道的那个不用提RNA,就可
以做qPCR 的kit吗?十分感谢
smartkevin: 多谢你帮我查的plate, 我先打电话问问corning,看他们的这个plate怎么
work的,希望fit my story
目前这个实验是在broad做的,但broad里的人都用贴壁细胞,这样remove medium的时候,
细胞都不会少,所以他们对我的悬浮细胞也没什么好的建议.
多谢各位了.
【在 y****i 的大作中提到】
: cell-to-ct kit at the broad?
| y****i
发帖数: 2194 | 17 abi的这套kit对付悬浮细胞基本没办法 尤其是量大的情况
我估计你们要自己重新develop assay了
我们实验室是最早在broad做这套qpcr screen的
别说悬浮细胞了 只要是不贴壁足够牢的细胞
被那个机器洗下来完全就都是七零八落的
broad最近不是在做什么nanostring么？我估计你们换那个assay试试看？
候,
【在 p*****r 的大作中提到】
: 多谢大家的建议.
: aishang,我目前就想用机器先remove大部分的medium,剩下约8ul的medium (如果剩下的
: medium太少的话,机器的tip头就会很容易带走细胞),然后多加一些lysis buffer.虽然
: 这样lysis buffer被稀释了,但可以试试能不能拿到足够的RNA.
: ArtyArty: 我目前用的是Cell to CT kit, 它提供lysis buffer, stop buffer,裂解细
: 胞后,可以拿到RNA, 然后RT 后拿到cDNA.你能不能告诉我你知道的那个不用提RNA,就可
: 以做qPCR 的kit吗?十分感谢
: smartkevin: 多谢你帮我查的plate, 我先打电话问问corning,看他们的这个plate怎么
: work的,希望fit my story
: 目前这个实验是在broad做的,但broad里的人都用贴壁细胞,这样remove medium的时候,
| a*****g
发帖数: 543 | 18 nanostring 出high throughput了？
我以为他们还是一dozen一dozen的卖呢...
abi的这套kit对付悬浮细胞基本没办法 尤其是量大的情况
我估计你们要自己重新develop assay了
我们实验室是最早在broad做这套qpcr screen的
别说悬浮细胞了 只要是不贴壁足够牢的细胞
被那个机器洗下来完全就都是七零八落的
broad最近不是在做什么nanostring么？我估计你们换那个assay试试看？
候,
【在 y****i 的大作中提到】
: abi的这套kit对付悬浮细胞基本没办法 尤其是量大的情况
: 我估计你们要自己重新develop assay了
: 我们实验室是最早在broad做这套qpcr screen的
: 别说悬浮细胞了 只要是不贴壁足够牢的细胞
: 被那个机器洗下来完全就都是七零八落的
: broad最近不是在做什么nanostring么？我估计你们换那个assay试试看？
:
: 候,
| A******y
发帖数: 2041 | 19 http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Nucleic-Acid-Amplification-and-Expression-Profiling/qRT-PCR/Direct-from-Cells.html
Is this the similar kit you are using? If it is, then you are not really
isolating RNA. The concept is really simple. You can make a custom lysis
buffer and run it with media in theory. | p*****r
发帖数: 64 | 20 看来yetiti在broad也做过啊。不知道你是Golud lab的吗？他lab里面的人估计有些办
法。对于nanostring我看了一下，估计不能马上上手，远水解不了近渴啊。
多谢ArtyArty提供的kit的信息，这个kit第一步就要求remove medium，还是回到了我
现在的问题，所以换这个kit也不能解决问题啊。但还是很感谢你。
【在 A******y 的大作中提到】
: http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Nucleic-Acid-Amplification-and-Expression-Profiling/qRT-PCR/Direct-from-Cells.html
: Is this the similar kit you are using? If it is, then you are not really
: isolating RNA. The concept is really simple. You can make a custom lysis
: buffer and run it with media in theory.
| | | p*****r
发帖数: 64 | 21 看来yetiti在broad也做过啊。不知道你是Golud lab的吗？他lab里面的人估计有些办
法。对于nanostring我看了一下，估计不能马上上手，远水解不了近渴啊。
多谢ArtyArty提供的kit的信息，这个kit第一步就要求remove medium，还是回到了我
现在的问题，所以换这个kit也不能解决问题啊。但还是很感谢你。
【在 A******y 的大作中提到】
: http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Nucleic-Acid-Amplification-and-Expression-Profiling/qRT-PCR/Direct-from-Cells.html
: Is this the similar kit you are using? If it is, then you are not really
: isolating RNA. The concept is really simple. You can make a custom lysis
: buffer and run it with media in theory.
| A******y
发帖数: 2041 | 22 Well, you do know removal of media is to help lysis and remove potential
problems. In theory, you can run the RT-PCR without removal of media, using
DNAase, and the stop solution...you just have to be careful about artifacts
. What's a little BSA going to affect your RT-PCR if you are running it in
cell lysates already? | p*****r
发帖数: 64 | 23 既要不太影响细胞数，又不能完全吸走medium，我只能留下～8ulmedium，多加一些了
lysis bf，看看结果如何了。
using
artifacts
in
【在 A******y 的大作中提到】
: Well, you do know removal of media is to help lysis and remove potential
: problems. In theory, you can run the RT-PCR without removal of media, using
: DNAase, and the stop solution...you just have to be careful about artifacts
: . What's a little BSA going to affect your RT-PCR if you are running it in
: cell lysates already?
| t*e
发帖数: 47 | 24 Pall corporation sells this kind of filter bottom plates, both 96 and 384
well.
了.
【在 p*****r 的大作中提到】
: hei, smartkevin 我怎么把滤筛放到每个孔里呢? 用vaccum可以吸掉medium,细胞留在
: 孔里吗?如果这个可行的话,真是个good idea. 请问能帮我查查滤筛的cat#吗? 多谢了.
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