m**********d
发帖数: 137 | 1 原来用agarose beads做IP，最后recover protein的时候，加loading buffer到beads
里煮一会。现在第一次用Invitrogen的Dynal beads，请问大家都怎么elute protein下
来呢 |
W****C
发帖数: 1937 | |
c*********r
发帖数: 1312 | 3 不能重复使用beads吗？
【在 W****C 的大作中提到】
: 同样 95度 5分钟 或者 70度 15分钟
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T**********t
发帖数: 1604 | 4 Streptavidin-biotin的binding特别强，不变性弄不下来，所以没法重复使用。
【在 c*********r 的大作中提到】
: 不能重复使用beads吗？
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w******e
发帖数: 1187 | 5 其实一个biotin跟SA的binding ms没想象的NB。我把biotinylated aptamer
coat到SA beads上做过sandwich assay，结果发现heat后掉下来的
aptamer造成极大background。杯具。。。
【在 T**********t 的大作中提到】
: Streptavidin-biotin的binding特别强，不变性弄不下来，所以没法重复使用。
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T**********t
发帖数: 1604 | 6 我没做过单biotin label的，都是直接上dual biotin，结合得很牢靠。跑PCR都没问题。
【在 w******e 的大作中提到】
: 其实一个biotin跟SA的binding ms没想象的NB。我把biotinylated aptamer
: coat到SA beads上做过sandwich assay，结果发现heat后掉下来的
: aptamer造成极大background。杯具。。。
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T**********t
发帖数: 1604 | 7 那你不加热呢？会不会好一点。
【在 w******e 的大作中提到】
: 其实一个biotin跟SA的binding ms没想象的NB。我把biotinylated aptamer
: coat到SA beads上做过sandwich assay，结果发现heat后掉下来的
: aptamer造成极大background。杯具。。。
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w******e
发帖数: 1187 | 8 我的assay是biotin RNA beads+protein +unlabeled alternative RNA,
要elute unlabeled RNA的话除了heat外有什么比较保险的方法吗？
0.1M NaOH?
【在 T**********t 的大作中提到】
: 那你不加热呢？会不会好一点。
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w******e
发帖数: 1187 | 9 有什么好办法往RNA上label多个biotin否？
题。
【在 T**********t 的大作中提到】
: 我没做过单biotin label的，都是直接上dual biotin，结合得很牢靠。跑PCR都没问题。
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T**********t
发帖数: 1604 | 10 估计不行，RNA容易被NaOH溶液水解。
我没做过这个assay，暂时能想到的也就是给biotin-RNA弄上个dual biotin label，让
它抓得更牢一点。在IDT合成的RNA是可以直接订带dual biotin label的，但是如果要
自己在实验室label的话我就不知道了，应该有kit买的。
【在 w******e 的大作中提到】
: 我的assay是biotin RNA beads+protein +unlabeled alternative RNA,
: 要elute unlabeled RNA的话除了heat外有什么比较保险的方法吗？
: 0.1M NaOH?
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w******e
发帖数: 1187 | 11 俺的RNA巨长，还是2'F modified，合成要成千上万刀。。。杯具。。。
我买的kit只能label一个biotin。。。anyway，其实也可以改一下primer sequence
能distinguish labelled/nonlabelled RNA就行，我就是懒。。。
【在 T**********t 的大作中提到】
: 估计不行，RNA容易被NaOH溶液水解。
: 我没做过这个assay，暂时能想到的也就是给biotin-RNA弄上个dual biotin label，让
: 它抓得更牢一点。在IDT合成的RNA是可以直接订带dual biotin label的，但是如果要
: 自己在实验室label的话我就不知道了，应该有kit买的。
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T**********t
发帖数: 1604 | 12 巨长是多长？太长的话你可以买一段短的RNA然后跟你的长的RNA片段ligate起来。
【在 w******e 的大作中提到】
: 俺的RNA巨长，还是2'F modified，合成要成千上万刀。。。杯具。。。
:
: 我买的kit只能label一个biotin。。。anyway，其实也可以改一下primer sequence
: 能distinguish labelled/nonlabelled RNA就行，我就是懒。。。
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s******s
发帖数: 13035 | 13 SA应该是4个domain？一般都是多biotin,想想pKa*4,恐怖
【在 w******e 的大作中提到】
: 其实一个biotin跟SA的binding ms没想象的NB。我把biotinylated aptamer
: coat到SA beads上做过sandwich assay，结果发现heat后掉下来的
: aptamer造成极大background。杯具。。。
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s******s
发帖数: 13035 | 14 为啥会有unlabeled? 是指background么？
w
【在 w******e 的大作中提到】
: 我的assay是biotin RNA beads+protein +unlabeled alternative RNA,
: 要elute unlabeled RNA的话除了heat外有什么比较保险的方法吗？
: 0.1M NaOH?
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s******s
发帖数: 13035 | 15 换其他的kit? 不是biotin-UTP一类的么？
【在 w******e 的大作中提到】
: 俺的RNA巨长，还是2'F modified，合成要成千上万刀。。。杯具。。。
:
: 我买的kit只能label一个biotin。。。anyway，其实也可以改一下primer sequence
: 能distinguish labelled/nonlabelled RNA就行，我就是懒。。。
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w******e
发帖数: 1187 | 16 80base。
嗯，我把splint ligation的东西都买了，就是懒得做。。。
【在 T**********t 的大作中提到】
: 巨长是多长？太长的话你可以买一段短的RNA然后跟你的长的RNA片段ligate起来。
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w******e
发帖数: 1187 | 17 pKa??你是说Kd吧？
【在 s******s 的大作中提到】
: SA应该是4个domain？一般都是多biotin,想想pKa*4,恐怖
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w******e
发帖数: 1187 | 18 unlabeled RNA binds to different site on the protein (hence the sandwich),
and is measured w/ qRT-PCR for read out. However, my labeled aptamer
has the same primer. hence the 杯具。。。其实主要是一直就没想到biotinylated
RNA会fall off，troubleshoot了好久。。。
【在 s******s 的大作中提到】
: 为啥会有unlabeled? 是指background么？
: w
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w******e
发帖数: 1187 | 19 给个link？我用的kit是这个：
http://www.piercenet.com/browse.cfm?fldID=AD32B746-5056-8A76-4E
我只能label ends，不然可以用biotin-NTP加到synthesis reaction里。。。
【在 s******s 的大作中提到】
: 换其他的kit? 不是biotin-UTP一类的么？
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