g*******f
发帖数: 427 | 1 最近在做 ChIP 看PPARgamma 的转录调控，一个月了也没出什么结果，用的是
Millipore 的EZ ChIP Kit, IgG阴性对照总是出现挺强的带，， RNA Polymerase2 阳
性对照的带却很弱，似乎没有理由怀疑试剂盒的RNA Polymerase2 抗体有问题啊? 以前
做NF-kappaB 一直都做得挺好的，只是用的是不同的试剂盒而已。 还请做这个方面的
指教一二。多谢了
BTW，偶然翻到了尚永丰的主页，上面有这么一句 "在世界上首次建立了哺乳动物细胞
染色质免疫沉淀技术（ChIP）"
http://www.bjmu.edu.cn/art/2009/12/6/art_8_39651.html
让我觉得挺 shock 的，原来这个技术是他"建立"的 难以置信啊 |
s*****t
发帖数: 107 | 2 TF的chIP 和Histon的chiP不一样。
Upsate的 protocol只适用于Histon的chIP不能用于TF的chIP
我建议你try一下Themo 的kit，他家是用酶切的。 |
d****7
发帖数: 109 | 3 PPARgamma的ChIP有难度，但是RNA polII的ChIP signal应该很强啊，你说IgG信号强，
我觉得
很可能是试剂盒的buffer污染了，我当初用Millipore的方法的时候就出现了这个问题
，我的TF没信
号，IgG信号极强。后来觉得是污染，我就自己配Buffer，不用试剂盒的buffer，然后
就变成IgG和
我的TF都没带了，至少解决了污染问题。
后来我发现，Millipore这个方法有SDS在lysis buffer里，对于结合力强或者表达量高
的蛋白很容
易出结果，比如SRF,ELK1之类的，我的TF表达量低，结合力也弱，怎么做都出不来，后
来我换了个
protocol，是Riachar Young's Lab protocol，就好了！
尚勇丰建立ChIP,真搞笑，哈哈
【在 g*******f 的大作中提到】
: 最近在做 ChIP 看PPARgamma 的转录调控，一个月了也没出什么结果，用的是
: Millipore 的EZ ChIP Kit, IgG阴性对照总是出现挺强的带，， RNA Polymerase2 阳
: 性对照的带却很弱，似乎没有理由怀疑试剂盒的RNA Polymerase2 抗体有问题啊? 以前
: 做NF-kappaB 一直都做得挺好的，只是用的是不同的试剂盒而已。 还请做这个方面的
: 指教一二。多谢了
: BTW，偶然翻到了尚永丰的主页，上面有这么一句 "在世界上首次建立了哺乳动物细胞
: 染色质免疫沉淀技术（ChIP）"
: http://www.bjmu.edu.cn/art/2009/12/6/art_8_39651.html
: 让我觉得挺 shock 的，原来这个技术是他"建立"的 难以置信啊
|
g*******f
发帖数: 427 | 4 多谢两位指点，dbrg77老哥的信息很有用，看来确实是试剂盒的问题，我以前用
millipore 的做 NF-kappaB p65做得好好的，虽然PCR IgG的对照也有weak 的带,但是
p65 IP 的还是很特异的。 我得试试Young 的 protocol |
a****d
发帖数: 1919 | 5 CHIP assay 最早是Ron Mckay建立的吧，称作 Mckay assay.
An immunoassay for the interaction between an SV40 T antigen related protein
and DNA.
J. Mol. Biol. 1981
至于在哺乳动物细胞里面用类似方法，是否尚永丰是第一人，就不清楚了。
【在 g*******f 的大作中提到】
: 最近在做 ChIP 看PPARgamma 的转录调控，一个月了也没出什么结果，用的是
: Millipore 的EZ ChIP Kit, IgG阴性对照总是出现挺强的带，， RNA Polymerase2 阳
: 性对照的带却很弱，似乎没有理由怀疑试剂盒的RNA Polymerase2 抗体有问题啊? 以前
: 做NF-kappaB 一直都做得挺好的，只是用的是不同的试剂盒而已。 还请做这个方面的
: 指教一二。多谢了
: BTW，偶然翻到了尚永丰的主页，上面有这么一句 "在世界上首次建立了哺乳动物细胞
: 染色质免疫沉淀技术（ChIP）"
: http://www.bjmu.edu.cn/art/2009/12/6/art_8_39651.html
: 让我觉得挺 shock 的，原来这个技术是他"建立"的 难以置信啊
|
s*****t
发帖数: 107 | 6 正在做ChIP， 准备使用Young Lab的protocol，
请问你在用young lab的protocl的时候在reverse crosslink的时候是怎么做的
好像reverse crosslink 都很麻烦。
我现在在mIgG 的ctrl里面都能扩出band。请问你是怎么解决的？
【在 d****7 的大作中提到】
: PPARgamma的ChIP有难度，但是RNA polII的ChIP signal应该很强啊，你说IgG信号强，
: 我觉得
: 很可能是试剂盒的buffer污染了，我当初用Millipore的方法的时候就出现了这个问题
: ，我的TF没信
: 号，IgG信号极强。后来觉得是污染，我就自己配Buffer，不用试剂盒的buffer，然后
: 就变成IgG和
: 我的TF都没带了，至少解决了污染问题。
: 后来我发现，Millipore这个方法有SDS在lysis buffer里，对于结合力强或者表达量高
: 的蛋白很容
: 易出结果，比如SRF,ELK1之类的，我的TF表达量低，结合力也弱，怎么做都出不来，后
|
m*****u
发帖数: 15526 | 7 请问你做p65 ChIP用的啥抗体？能给个具体信息吗？谢谢
【在 g*******f 的大作中提到】
: 多谢两位指点，dbrg77老哥的信息很有用，看来确实是试剂盒的问题，我以前用
: millipore 的做 NF-kappaB p65做得好好的，虽然PCR IgG的对照也有weak 的带,但是
: p65 IP 的还是很特异的。 我得试试Young 的 protocol
|
b******e
发帖数: 3348 | 8 upstate不能用于tf有什么根据吗？我看文献上很多人用他家的kit做tf的啊。
【在 s*****t 的大作中提到】
: TF的chIP 和Histon的chiP不一样。
: Upsate的 protocol只适用于Histon的chIP不能用于TF的chIP
: 我建议你try一下Themo 的kit，他家是用酶切的。
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q****2
发帖数: 208 | 9
cell signal 的不错
【在 m*****u 的大作中提到】
: 请问你做p65 ChIP用的啥抗体？能给个具体信息吗？谢谢
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g*******f
发帖数: 427 | 10 最近在做 ChIP 看PPARgamma 的转录调控，一个月了也没出什么结果，用的是
Millipore 的EZ ChIP Kit, IgG阴性对照总是出现挺强的带，， RNA Polymerase2 阳
性对照的带却很弱，似乎没有理由怀疑试剂盒的RNA Polymerase2 抗体有问题啊? 以前
做NF-kappaB 一直都做得挺好的，只是用的是不同的试剂盒而已。 还请做这个方面的
指教一二。多谢了
BTW，偶然翻到了尚永丰的主页，上面有这么一句 "在世界上首次建立了哺乳动物细胞
染色质免疫沉淀技术（ChIP）"
http://www.bjmu.edu.cn/art/2009/12/6/art_8_39651.html
让我觉得挺 shock 的，原来这个技术是他"建立"的 难以置信啊 |
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s*****t
发帖数: 107 | 11 TF的chIP 和Histon的chiP不一样。
Upsate的 protocol只适用于Histon的chIP不能用于TF的chIP
我建议你try一下Themo 的kit，他家是用酶切的。 |
d****7
发帖数: 109 | 12 PPARgamma的ChIP有难度，但是RNA polII的ChIP signal应该很强啊，你说IgG信号强，
我觉得
很可能是试剂盒的buffer污染了，我当初用Millipore的方法的时候就出现了这个问题
，我的TF没信
号，IgG信号极强。后来觉得是污染，我就自己配Buffer，不用试剂盒的buffer，然后
就变成IgG和
我的TF都没带了，至少解决了污染问题。
后来我发现，Millipore这个方法有SDS在lysis buffer里，对于结合力强或者表达量高
的蛋白很容
易出结果，比如SRF,ELK1之类的，我的TF表达量低，结合力也弱，怎么做都出不来，后
来我换了个
protocol，是Riachar Young's Lab protocol，就好了！
尚勇丰建立ChIP,真搞笑，哈哈
【在 g*******f 的大作中提到】
: 最近在做 ChIP 看PPARgamma 的转录调控，一个月了也没出什么结果，用的是
: Millipore 的EZ ChIP Kit, IgG阴性对照总是出现挺强的带，， RNA Polymerase2 阳
: 性对照的带却很弱，似乎没有理由怀疑试剂盒的RNA Polymerase2 抗体有问题啊? 以前
: 做NF-kappaB 一直都做得挺好的，只是用的是不同的试剂盒而已。 还请做这个方面的
: 指教一二。多谢了
: BTW，偶然翻到了尚永丰的主页，上面有这么一句 "在世界上首次建立了哺乳动物细胞
: 染色质免疫沉淀技术（ChIP）"
: http://www.bjmu.edu.cn/art/2009/12/6/art_8_39651.html
: 让我觉得挺 shock 的，原来这个技术是他"建立"的 难以置信啊
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g*******f
发帖数: 427 | 13 多谢两位指点，dbrg77老哥的信息很有用，看来确实是试剂盒的问题，我以前用
millipore 的做 NF-kappaB p65做得好好的，虽然PCR IgG的对照也有weak 的带,但是
p65 IP 的还是很特异的。 我得试试Young 的 protocol |
a****d
发帖数: 1919 | 14 CHIP assay 最早是Ron Mckay建立的吧，称作 Mckay assay.
An immunoassay for the interaction between an SV40 T antigen related protein
and DNA.
J. Mol. Biol. 1981
至于在哺乳动物细胞里面用类似方法，是否尚永丰是第一人，就不清楚了。
【在 g*******f 的大作中提到】
: 最近在做 ChIP 看PPARgamma 的转录调控，一个月了也没出什么结果，用的是
: Millipore 的EZ ChIP Kit, IgG阴性对照总是出现挺强的带，， RNA Polymerase2 阳
: 性对照的带却很弱，似乎没有理由怀疑试剂盒的RNA Polymerase2 抗体有问题啊? 以前
: 做NF-kappaB 一直都做得挺好的，只是用的是不同的试剂盒而已。 还请做这个方面的
: 指教一二。多谢了
: BTW，偶然翻到了尚永丰的主页，上面有这么一句 "在世界上首次建立了哺乳动物细胞
: 染色质免疫沉淀技术（ChIP）"
: http://www.bjmu.edu.cn/art/2009/12/6/art_8_39651.html
: 让我觉得挺 shock 的，原来这个技术是他"建立"的 难以置信啊
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s*****t
发帖数: 107 | 15 正在做ChIP， 准备使用Young Lab的protocol，
请问你在用young lab的protocl的时候在reverse crosslink的时候是怎么做的
好像reverse crosslink 都很麻烦。
我现在在mIgG 的ctrl里面都能扩出band。请问你是怎么解决的？
【在 d****7 的大作中提到】
: PPARgamma的ChIP有难度，但是RNA polII的ChIP signal应该很强啊，你说IgG信号强，
: 我觉得
: 很可能是试剂盒的buffer污染了，我当初用Millipore的方法的时候就出现了这个问题
: ，我的TF没信
: 号，IgG信号极强。后来觉得是污染，我就自己配Buffer，不用试剂盒的buffer，然后
: 就变成IgG和
: 我的TF都没带了，至少解决了污染问题。
: 后来我发现，Millipore这个方法有SDS在lysis buffer里，对于结合力强或者表达量高
: 的蛋白很容
: 易出结果，比如SRF,ELK1之类的，我的TF表达量低，结合力也弱，怎么做都出不来，后
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m*****u
发帖数: 15526 | 16 请问你做p65 ChIP用的啥抗体？能给个具体信息吗？谢谢
【在 g*******f 的大作中提到】
: 多谢两位指点，dbrg77老哥的信息很有用，看来确实是试剂盒的问题，我以前用
: millipore 的做 NF-kappaB p65做得好好的，虽然PCR IgG的对照也有weak 的带,但是
: p65 IP 的还是很特异的。 我得试试Young 的 protocol
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b******e
发帖数: 3348 | 17 upstate不能用于tf有什么根据吗？我看文献上很多人用他家的kit做tf的啊。
【在 s*****t 的大作中提到】
: TF的chIP 和Histon的chiP不一样。
: Upsate的 protocol只适用于Histon的chIP不能用于TF的chIP
: 我建议你try一下Themo 的kit，他家是用酶切的。
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q****2
发帖数: 208 | 18
cell signal 的不错
【在 m*****u 的大作中提到】
: 请问你做p65 ChIP用的啥抗体？能给个具体信息吗？谢谢
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g*******f
发帖数: 427 | 19 对，就是cell signal 的，很好用，非常特异。 |
