D*****y
发帖数: 95 | 1 请教高位Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)高手，ChIP最后的得到的DNA用PCR来
检测，现在Reviewer要求用Q-PCR检测，我是不是可以用总input的DNA和抗体IP后恢复
的DNA来进行Q-PCR(用一特定primer），然后取两者的Ratio来Normalization作为最终
结果？请问大家是怎么做的呢？感谢！！ |
s*********t
发帖数: 600 | 2 取1%的input
IgG和抗体分别IP后恢复的DNA，加上input的DNA，各自用同一引物做Q-PCR，IgG
control和抗体分别对input做normalization
【在 D*****y 的大作中提到】
: 请教高位Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)高手，ChIP最后的得到的DNA用PCR来
: 检测，现在Reviewer要求用Q-PCR检测，我是不是可以用总input的DNA和抗体IP后恢复
: 的DNA来进行Q-PCR(用一特定primer），然后取两者的Ratio来Normalization作为最终
: 结果？请问大家是怎么做的呢？感谢！！
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D*****y
发帖数: 95 | 3 可是IgG IP后，PCR后什么信号也没有，如何对input DNA作normalization? 请指教。
谢谢 |
c**********e
发帖数: 230 | 4 negative control你指望有什么信号? 有background就行了. |
s*********t
发帖数: 600 | 5 PCR看不到
QPCR还是会有cp值的
除以1%的input，大概在0.0几%
就是负对照了
【在 D*****y 的大作中提到】
: 可是IgG IP后，PCR后什么信号也没有，如何对input DNA作normalization? 请指教。
: 谢谢
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m**********a
发帖数: 2 | 6 最好做一个标准曲线,然后用得出的量去normalize input. |
s*********t
发帖数: 600 | 7 楼主别听这个，不要越弄越复杂
按我的那个做
【在 m**********a 的大作中提到】
: 最好做一个标准曲线,然后用得出的量去normalize input.
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f********s
发帖数: 115 | 8 做CHIP的同时，要保留一定体积的input,我们一般保留10%的input.比如说，用150ul的
DNA做CHIP,保留15ul作为input.CHIP-DNA和input-DNA用同样的方式purify到同样的体
积里。做QPCR的时候，先将input做梯度稀释，做出一个标准曲线。比如说稀释五倍。
第一个点是10% input, 第二个点2%input，第三个点0.4%input....PCR仪会根据你的标
准曲线，计算CHIP-DNA相当于x% input.这就是你的normalize 过后的值。
对于不同的细胞要用不同的标准曲线，比如说WT，要有WT的标准曲线；Mut,要有Mut的
标准曲线。这个时候IgG作为negetive control，比如说相当于0.03%input；那你的
postive signal 就可能是相当于0.3% input（相对于IgG 有10倍enrichement）。
【在 D*****y 的大作中提到】
: 请教高位Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)高手，ChIP最后的得到的DNA用PCR来
: 检测，现在Reviewer要求用Q-PCR检测，我是不是可以用总input的DNA和抗体IP后恢复
: 的DNA来进行Q-PCR(用一特定primer），然后取两者的Ratio来Normalization作为最终
: 结果？请问大家是怎么做的呢？感谢！！
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