q**********0
发帖数: 335 | 1 用CO-immunoprecipitation (CO-IP)研究两个蛋白的相互作用, 作IP时，请问增加cell
lysate的量，或cell lysate与抗体－beads 的incubate时间会增加IP的阳性程度吗？
Thanks a lot! |
w***a
发帖数: 1053 | 2 lysate多了，效果是好些
关于ab和beads，我一般过夜，2个小时也做过，感觉过夜好些，不是很确定。
个人经验，抛砖引玉。 |
V********n
发帖数: 305 | 3 理论上都能增加阳性程度，但也可能增加假阳性。俺的经验，供参考。
１）增加lysate，同时增加incubation volume（相当于保持蛋白浓度不变，或者降低
蛋白浓度），有助于降低non-specific
２）incubation时间不要过长，若干小时，最长过夜吧
３）最后清洗充分 |
q**********0
发帖数: 335 | 4 Thank you very much! Very helpful! |
d******y
发帖数: 16 | 5 增加lysate的量, 抗体的量也可能需要相应增加才行. |
s******n
发帖数: 63 | 6 我觉得抗体不好用的话，增加抗体量也是杯水车薪。
【在 d******y 的大作中提到】
: 增加lysate的量, 抗体的量也可能需要相应增加才行.
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w***a
发帖数: 1053 | 7 增加lysate，又增加体积，结果和都不增加一样。
增加lysate，过夜incubate，洗的时候加大盐浓度和detergent浓度，votex几下,要洗
的negative ctrl没了。
不过关键还是抗体，最好是over expressing，用一些常用tag。
如果是endogenous互相pull down，需要很好的抗体才行,抗体不好，就是有相互作用也
做不出来。
如果觉得可能性很大，gst pull down吧,这个比ip靠谱。
【在 V********n 的大作中提到】
: 理论上都能增加阳性程度，但也可能增加假阳性。俺的经验，供参考。
: １）增加lysate，同时增加incubation volume（相当于保持蛋白浓度不变，或者降低
: 蛋白浓度），有助于降低non-specific
: ２）incubation时间不要过长，若干小时，最长过夜吧
: ３）最后清洗充分
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w*****n
发帖数: 310 | 8 protein-protein interaction 我只相信细胞内超表达的IF数据。 |
I*****y
发帖数: 6402 | 9 IF能告诉你protein-protein interaction这样的结论吗？你的蛋白直径多大？你的显
微镜分辨率又是多大？
【在 w*****n 的大作中提到】
: protein-protein interaction 我只相信细胞内超表达的IF数据。
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h*******n
发帖数: 2052 | 10 我最不相信IF的数据， 跟不要说是overexpression的了
【在 w*****n 的大作中提到】
: protein-protein interaction 我只相信细胞内超表达的IF数据。
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