b********c
发帖数: 161 | 1 2个性质,大小,pI，蛋白序列都非常相似的蛋白（paralogs）A 和 B，用的pET15b
vector， 在e.coli(DE3)中加IPTG诱导表达，然后粉碎细胞后，提取上清液可溶总蛋白
跑SDS-PAGE,A可以看到诱导的目的蛋白， 但B看不到诱导的条带。 直接load这2个蛋白
的诱导前和诱导后的 crude cell culture，A和B都可以看到诱导后的目的蛋白。所以
我不知道为什么B蛋白在粉碎细胞后不在可溶蛋白部分，甚至一点都没有，如果是形成
了inclusion body，难道一点都不剩在可溶部分里面？
我测过序列，都是正确连接的，而且用 crude cell culture做相关的生化实验，也发
现了这两个酶的效率是很高的。 |
o*****r
发帖数: 156 | 2 It is possible that B protein ends up in the inclusion body. But I'm
surprised that you detected the activity for whole cell lysate. One thing
you can do to check if B was expressed in IB is to run a gel for the
insoluble fraction of the cell lysate.
【在 b********c 的大作中提到】
: 2个性质,大小,pI，蛋白序列都非常相似的蛋白（paralogs）A 和 B，用的pET15b
: vector， 在e.coli(DE3)中加IPTG诱导表达，然后粉碎细胞后，提取上清液可溶总蛋白
: 跑SDS-PAGE,A可以看到诱导的目的蛋白， 但B看不到诱导的条带。 直接load这2个蛋白
: 的诱导前和诱导后的 crude cell culture，A和B都可以看到诱导后的目的蛋白。所以
: 我不知道为什么B蛋白在粉碎细胞后不在可溶蛋白部分，甚至一点都没有，如果是形成
: 了inclusion body，难道一点都不剩在可溶部分里面？
: 我测过序列，都是正确连接的，而且用 crude cell culture做相关的生化实验，也发
: 现了这两个酶的效率是很高的。
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Z******5
发帖数: 435 | 3 看是不是在inclusion body里很简单啊，收菌洗两遍后，超声破碎，然后离心，上清和
沉淀分别用loading buffer溶解，泡脚。 |
Z******5
发帖数: 435 | 4 不过你的既然能测到活性，应该还是有可溶的。 很有可能是可溶的部分量很少，要不
你把裂解液上清泡脚后做银染看看。
还有一种可能，看你的描述，难道另一个蛋白是分泌到培养基中了？ |
g****y
发帖数: 90 | 5
~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~
看不到不代表没有，或许多养几升菌，过个Ni柱就能看到了；或者弄个抗体杂
一下，十有八九能看到。
~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~
这个就不严谨了吧，如果一点都不剩，那你的生化活性是哪来的？？
【在 b********c 的大作中提到】
: 2个性质,大小,pI，蛋白序列都非常相似的蛋白（paralogs）A 和 B，用的pET15b
: vector， 在e.coli(DE3)中加IPTG诱导表达，然后粉碎细胞后，提取上清液可溶总蛋白
: 跑SDS-PAGE,A可以看到诱导的目的蛋白， 但B看不到诱导的条带。 直接load这2个蛋白
: 的诱导前和诱导后的 crude cell culture，A和B都可以看到诱导后的目的蛋白。所以
: 我不知道为什么B蛋白在粉碎细胞后不在可溶蛋白部分，甚至一点都没有，如果是形成
: 了inclusion body，难道一点都不剩在可溶部分里面？
: 我测过序列，都是正确连接的，而且用 crude cell culture做相关的生化实验，也发
: 现了这两个酶的效率是很高的。
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g********4
发帖数: 4959 | 6 大家回帖的真的是做科研的？根据LZ这个论述，说明这活性应是本底，也就是e coli自
己的内在酶活性。说明这个分析方法不能使用lz的目的。 |
b********c
发帖数: 161 | 7 表达的是外源蛋白不是内在酶。多谢楼上几位的回复， 我其实就想在可溶上清里面找
到蛋白而已，因为我太怀疑全部表达蛋白都跑到inclusion body 里面去了。而且类似
的4，5个蛋白基本都在可溶上清里面提纯的出来。
【在 g********4 的大作中提到】
: 大家回帖的真的是做科研的？根据LZ这个论述，说明这活性应是本底，也就是e coli自
: 己的内在酶活性。说明这个分析方法不能使用lz的目的。
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s*******e
发帖数: 1010 | 8 你怎么知道人家没做空白参照呢？
【在 g********4 的大作中提到】
: 大家回帖的真的是做科研的？根据LZ这个论述，说明这活性应是本底，也就是e coli自
: 己的内在酶活性。说明这个分析方法不能使用lz的目的。
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N*******k
发帖数: 270 | 9 我曾经表达过两个氨基酸相似率高达92%的细胞因子A和B， A是怎么搞也没有可溶性的
蛋白；而B，可溶性表达是惊人的高， 一升的培养体系，可以搞出4mg.
可悲的是,我是从A开始的,浪费了一年半的时间,尝试了各种条件,温度,IPTG浓度,时间,
改成细菌偏好的密码子等等;而在我之前,一名博后也花费了大量时间在这上面,最后她
是遗憾的走人.
我的体会是,尽量用低温和低的IPTG浓度,减缓包涵体生成的速度. |
n***w
发帖数: 2405 | 10
间,
我怎么隐约觉得我在重复你的悲剧。。。。
【在 N*******k 的大作中提到】
: 我曾经表达过两个氨基酸相似率高达92%的细胞因子A和B， A是怎么搞也没有可溶性的
: 蛋白；而B，可溶性表达是惊人的高， 一升的培养体系，可以搞出4mg.
: 可悲的是,我是从A开始的,浪费了一年半的时间,尝试了各种条件,温度,IPTG浓度,时间,
: 改成细菌偏好的密码子等等;而在我之前,一名博后也花费了大量时间在这上面,最后她
: 是遗憾的走人.
: 我的体会是,尽量用低温和低的IPTG浓度,减缓包涵体生成的速度.
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e****s
发帖数: 1125 | 11 每个上来问蛋白表达的人，我都问这个问题：
Expression test是用Western做的吗？
【在 b********c 的大作中提到】
: 表达的是外源蛋白不是内在酶。多谢楼上几位的回复， 我其实就想在可溶上清里面找
: 到蛋白而已，因为我太怀疑全部表达蛋白都跑到inclusion body 里面去了。而且类似
: 的4，5个蛋白基本都在可溶上清里面提纯的出来。
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m******5
发帖数: 1383 | 12 我觉得如果只能用western看见的话……纯化起来要难得见鬼了
我是说只能
【在 e****s 的大作中提到】
: 每个上来问蛋白表达的人，我都问这个问题：
: Expression test是用Western做的吗？
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n***w
发帖数: 2405 | 13 Re
如果在胶上能看见一点，我心里还好受一点。。。。
【在 m******5 的大作中提到】
: 我觉得如果只能用western看见的话……纯化起来要难得见鬼了
: 我是说只能
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b********c
发帖数: 161 | 14 没有做western，因为只想纯化这个蛋白，纯化不了的话，自然没必要做western blot
了 |
n***w
发帖数: 2405 | 15 做wb可以让你区分蛋白主要在哪里。有时候光跑胶看不出啥。
blot
【在 b********c 的大作中提到】
: 没有做western，因为只想纯化这个蛋白，纯化不了的话，自然没必要做western blot
: 了
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b******n
发帖数: 4225 | 16 我们实验室现在也有人表达两个蛋白，算是同一种蛋白
不过是来源于同一属不同种的细菌
氨基酸identity也是高达50%以上，一样的载体和宿主菌
一个表达量奇高，而且可溶性相当好，大概能得到>40mg/L
另外一个低的多，可能低于5mg/L
间,
【在 N*******k 的大作中提到】
: 我曾经表达过两个氨基酸相似率高达92%的细胞因子A和B， A是怎么搞也没有可溶性的
: 蛋白；而B，可溶性表达是惊人的高， 一升的培养体系，可以搞出4mg.
: 可悲的是,我是从A开始的,浪费了一年半的时间,尝试了各种条件,温度,IPTG浓度,时间,
: 改成细菌偏好的密码子等等;而在我之前,一名博后也花费了大量时间在这上面,最后她
: 是遗憾的走人.
: 我的体会是,尽量用低温和低的IPTG浓度,减缓包涵体生成的速度.
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e****s
发帖数: 1125 | 17 你有好的测活方法，不跑WB也可以。
我是有些不理解从SDS胶上看不到，就认为没有蛋白的。
做WB就是为了纯化蛋白。
很简单可以做的就是测Sup里面的活性，你好像只测了Total lysate的。你的试验结果
基本不能做出上清是否有可溶目标蛋白表达的结论。
要上清测出活力了，弄点Ni beads富集初提一下（你用pET,猜可能有His-tag），看比
活力有否提高。
blot
【在 b********c 的大作中提到】
: 没有做western，因为只想纯化这个蛋白，纯化不了的话，自然没必要做western blot
: 了
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c********0
发帖数: 29 | 18 pET 的vector 可以用 autoinducing medium 表达，表达的蛋白应该是可溶的。 |
A****w
发帖数: 244 | 19 There are a few strains of E.coli(DE3). Which one are you using? I found
Rossetta 2 cells (DE3) is better in my case. As mentioned, low temperature
and low iptg will help expression. Auto-induction is another way to try. Or
leaky expression??
It's hard to say things wrong in expression, even if A and B share >90%
similarity.
Good luck. |
b********c
发帖数: 161 | 20 多谢大家的分析,我终于找到原因了,我前2次做sonication做的不充分,结果细胞根本没
有完全裂解,今天重新做了次,就看到了可溶部分的蛋白了,但还是有一部分在pellet里
面.不过可溶部分的就够我用了.
真是太坑大家了,实在对不起. |
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n***w
发帖数: 2405 | 21 呵呵。sonication这种东西确实是需要empirically determined。
【在 b********c 的大作中提到】
: 多谢大家的分析,我终于找到原因了,我前2次做sonication做的不充分,结果细胞根本没
: 有完全裂解,今天重新做了次,就看到了可溶部分的蛋白了,但还是有一部分在pellet里
: 面.不过可溶部分的就够我用了.
: 真是太坑大家了,实在对不起.
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L********g
发帖数: 4204 | 22 right, that's why now I always use French Press to break cells instead of
sonication |
n***w
发帖数: 2405 | 23 请问一下一般french press多少钱？
谢谢。
【在 L********g 的大作中提到】
: right, that's why now I always use French Press to break cells instead of
: sonication
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L********g
发帖数: 4204 | 24 hehe, we use another lab's french press, they got it from a retired
professor for free, so I really don't know the price. |
s*******e
发帖数: 1010 | 25 he may only have several mL sample
【在 L********g 的大作中提到】
: right, that's why now I always use French Press to break cells instead of
: sonication
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d***y
发帖数: 1850 | 26 跑胶看不到，wb才能看到，最后能纯化出来的蛋白多了 |
d***y
发帖数: 1850 | 27 VERY expensive
【在 n***w 的大作中提到】
: 请问一下一般french press多少钱？
: 谢谢。
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