s******a
发帖数: 472 | 1 又来请教大家关于recombineering的问题了。因为重组是一个小概率事件（就算在重组
酶存在的情况下），所以就需要有筛选的策略。最简便高效的方法可以导入一个loxP-
Neo-loxP用于positive selection，最后可以利用cre重组酶去掉Neo。缺点是会留下一
个loxP位点，也不利于在该位点进行进一步的遗传操作。
鉴于此，我们决定采用positive/negative selection的方法进行recombineering。2种
常用方法包括galK筛选和rpsL-Kana筛选。我目前采用的是rpsL-Kana方法，Kana 使细
菌对Kanamycin有抗性，rpsL是细菌对streptomycin敏感。第一步recombineering
select “kana resistance”；第二步reombineering counter-select rpsL。
经过第一步，克隆PCR鉴定可以有95%正确率，即基本上所有克隆都带有重组的rpsL-
Kana。但是第二步（将rpsL-Kana替换为insert），获得阳性克隆如同中彩票一样，概
率很低。筛200-300的克隆也得不到一个阳性的（另外一个PhD的课题，同样的系统）。
这个成功率与文献报道的1%-29%（平均约15%）相差太远。与第一步相比，第二步的阳
性率低的一个合理解释是一些非特异的分子内重组等也会导致loss of rpsL-Kana
cassette，从而是细菌对streptomycin不敏感，成为背景。因此我做了这样的实验：将
第一步得到的阳性克隆（带有rpsL-Kana，理论上对streptomycin敏感），用含有不同
浓度（200ug/ml-2.5mg/ml)streptomycin的LB培养，高达2.5mg/ml的streptomycin也不
能抑制细菌生长（和没有streptomycin的一样）。
现在我就不能理解为什么在没有诱导重组蛋白表达的情况下这些rpsL-Kana克隆都对
streptomycin不敏感呢。各位有经验的同仁能否指点一下在下该怎么办呢？ |
x********u
发帖数: 430 | 2 Check your strain background. Do a negative control without rpsL-Kana and
see if your strain is still resistant to streptomycin. I guess your strain
is already carrying some genetic element which make them not sensitive to
stretomycin. |
R***t
发帖数: 14 | 3 You can read this recent paper:
http://www.nature.com/nmeth/journal/vaop/ncurrent/full/nmeth.18
【在 s******a 的大作中提到】
: 又来请教大家关于recombineering的问题了。因为重组是一个小概率事件（就算在重组
: 酶存在的情况下），所以就需要有筛选的策略。最简便高效的方法可以导入一个loxP-
: Neo-loxP用于positive selection，最后可以利用cre重组酶去掉Neo。缺点是会留下一
: 个loxP位点，也不利于在该位点进行进一步的遗传操作。
: 鉴于此，我们决定采用positive/negative selection的方法进行recombineering。2种
: 常用方法包括galK筛选和rpsL-Kana筛选。我目前采用的是rpsL-Kana方法，Kana 使细
: 菌对Kanamycin有抗性，rpsL是细菌对streptomycin敏感。第一步recombineering
: select “kana resistance”；第二步reombineering counter-select rpsL。
: 经过第一步，克隆PCR鉴定可以有95%正确率，即基本上所有克隆都带有重组的rpsL-
: Kana。但是第二步（将rpsL-Kana替换为insert），获得阳性克隆如同中彩票一样，概
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s******a
发帖数: 472 | |
s******a
发帖数: 472 | 5 我打算一边找他们要他们的系统，一边尝试解决问题。
估计要能够拿到他们的系统也需要一段时间。
【在 R***t 的大作中提到】
: You can read this recent paper:
: http://www.nature.com/nmeth/journal/vaop/ncurrent/full/nmeth.18
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s******a
发帖数: 472 | 6 我用的是SW102, 估计不同genetic background的strain对streptomycin的敏感性也不
同。 早先报道rpsL-kana筛选的paper他们用1mg/ml；但是genebridge公司
recombineering kit用rpsL-neo，他们用50ug/ml。怎么有这么大的差别呢。
我后来测了一下OD，2.5mg/ml streptomycin只能使OD600降低20%左右。
streptomycin不能完全抑制细菌生长，但是到底多大溶度才合适进行counter-
selection呢？
【在 x********u 的大作中提到】
: Check your strain background. Do a negative control without rpsL-Kana and
: see if your strain is still resistant to streptomycin. I guess your strain
: is already carrying some genetic element which make them not sensitive to
: stretomycin.
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x********u
发帖数: 430 | 7 Try 2*IC50
【在 s******a 的大作中提到】
: 我用的是SW102, 估计不同genetic background的strain对streptomycin的敏感性也不
: 同。 早先报道rpsL-kana筛选的paper他们用1mg/ml；但是genebridge公司
: recombineering kit用rpsL-neo，他们用50ug/ml。怎么有这么大的差别呢。
: 我后来测了一下OD，2.5mg/ml streptomycin只能使OD600降低20%左右。
: streptomycin不能完全抑制细菌生长，但是到底多大溶度才合适进行counter-
: selection呢？
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s******a
发帖数: 472 | 8 上次最高溶度2.5mg/ml，抑制20%。今天又做了一个1.25-20mg/ml范围的，明天应该知
道大概的IC50.
【在 x********u 的大作中提到】
: Try 2*IC50
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s******a
发帖数: 472 | 9 上次最高溶度2.5mg/ml，抑制20%。今天又做了一个1.25-20mg/ml范围的，明天应该知
道大概的IC50.
【在 x********u 的大作中提到】
: Try 2*IC50
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A********2
发帖数: 107 | 10 feels like the strain is resistant to strep even with rpsL |
s******a
发帖数: 472 | 11 You mean SW102 generally, or the one I am using?
【在 A********2 的大作中提到】
: feels like the strain is resistant to strep even with rpsL
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A********2
发帖数: 107 | 12 Sorry that I am not very familiar with rpsL counter selection but just feel
a bit strange that the resistance level is so high in the scale of mg/ml |
