s******y
发帖数: 28562 | 1 手头上有一堆retroviral vector (pBabe and pQC, PsR, etc.) 一直都是
用retroviral packaging system (GAG/PoL + VsvG)
最近想用lentiviral system,以前从来没有用过，所以想问一个白痴问题，
就是能不能直接用以前的vector装到lentiviral packaging system里面?
随便看了看lentiviral 的说明书，貌似好像没有问题？ |
d*p
发帖数: 534 | 2 I ever made a mistake, pack retro vector with lenti system. It failed. So I'
ll say NO. |
s******y
发帖数: 28562 | 3 如果是这样的话那可就太麻烦了。我可不想把我好不容易克隆到retro里面的东西
又倒腾克隆一次。。。
I'
【在 d*p 的大作中提到】
: I ever made a mistake, pack retro vector with lenti system. It failed. So I'
: ll say NO.
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r***e
发帖数: 2539 | 4 不行。
另外包装lenti也要注意，尽量用第三代的。
切记不能把不同generation的vector和pkg mix混用，
有的公司为了规避patent，还在出售第二代的vector，比如说Openbiosystem有名的pLK
O shRNA vector，和Thermo的部分产品。
以前有实验室出过事故，包装出不安全的病毒。
【在 s******y 的大作中提到】
: 手头上有一堆retroviral vector (pBabe and pQC, PsR, etc.) 一直都是
: 用retroviral packaging system (GAG/PoL + VsvG)
: 最近想用lentiviral system,以前从来没有用过，所以想问一个白痴问题，
: 就是能不能直接用以前的vector装到lentiviral packaging system里面?
: 随便看了看lentiviral 的说明书，貌似好像没有问题？
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i*****i
发帖数: 154 | 5 试过，效率确实很低。
为什么不在Addgene买一个包装的质粒pUMVC (Plasmid 8449),65刀就可以搞定了。如果
你参加今年的AACR的会的话儿，可以在Addgene拿一个免费的coupon，会赠送一个质粒。
或者买一个phenix cell，效率很高。 |
C*****h
发帖数: 926 | 6 什么安全事故？能具体说说吗？
pLK
【在 r***e 的大作中提到】
: 不行。
: 另外包装lenti也要注意，尽量用第三代的。
: 切记不能把不同generation的vector和pkg mix混用，
: 有的公司为了规避patent，还在出售第二代的vector，比如说Openbiosystem有名的pLK
: O shRNA vector，和Thermo的部分产品。
: 以前有实验室出过事故，包装出不安全的病毒。
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s******y
发帖数: 28562 | 7 Retroviral vector 只感染那些分裂中的细胞，对于不分裂或者不怎么分裂
的细胞（比方说原代细胞）不太好使。我有很多做在retroviral vector 里面
的蛋白，如果要一一转移到lentiviral vector 里挺花时间的。
不过听大伙的说法，这个貌似是没有办法的。。。
粒。
【在 i*****i 的大作中提到】
: 试过，效率确实很低。
: 为什么不在Addgene买一个包装的质粒pUMVC (Plasmid 8449),65刀就可以搞定了。如果
: 你参加今年的AACR的会的话儿，可以在Addgene拿一个免费的coupon，会赠送一个质粒。
: 或者买一个phenix cell，效率很高。
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s******y
发帖数: 28562 | 8 这么恐怖，怎么知道哪个是第三代？
pLK
【在 r***e 的大作中提到】
: 不行。
: 另外包装lenti也要注意，尽量用第三代的。
: 切记不能把不同generation的vector和pkg mix混用，
: 有的公司为了规避patent，还在出售第二代的vector，比如说Openbiosystem有名的pLK
: O shRNA vector，和Thermo的部分产品。
: 以前有实验室出过事故，包装出不安全的病毒。
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i*****i
发帖数: 154 | 9 二代和三代的差别，在packaging system上，由二代的Gag/pol/Rev + VSVG，变成了
Gag/pol+Rev+VSVG，两质粒变成三质粒。病毒的编码区的进一步分割，分离，可以降低
重组野生病毒（有自主复制和感染能力）的可能性。
比较典型的二代是pspax2+pMD2.G 以及pcmv dvpr 8.2+pCMV VSVG。
而比较典型的三代是pMDLg/pRRE+pRSV-Rev+pMD2.G, 以及Invitrogen的包装系统，都是
三代。
其实clontech的包装系统应该是第四代了，虽然这个系统采用了旧的驱动系统，但是对
整个病毒蛋白的编码区做了进一步的split，并引入了tet调控，所以，应该是更安全一
些。但是共转染7个质粒的效率，显然不如三个。所以，第二代系统仍然是titer最高的
最有效的系统。 |
s******y
发帖数: 28562 | 10 谢谢！
我从来没有用过lenti, 所以都不知道有这种差别。受教了。
另外，为什么retro vector 不能装进lenti 系统里面呢？难道他们的包装
信号差的很远么？
我一直误认为lenti就是多了一个强行进入细胞核的蛋白，这么看来还是有
别的差别？
【在 i*****i 的大作中提到】
: 二代和三代的差别，在packaging system上，由二代的Gag/pol/Rev + VSVG，变成了
: Gag/pol+Rev+VSVG，两质粒变成三质粒。病毒的编码区的进一步分割，分离，可以降低
: 重组野生病毒（有自主复制和感染能力）的可能性。
: 比较典型的二代是pspax2+pMD2.G 以及pcmv dvpr 8.2+pCMV VSVG。
: 而比较典型的三代是pMDLg/pRRE+pRSV-Rev+pMD2.G, 以及Invitrogen的包装系统，都是
: 三代。
: 其实clontech的包装系统应该是第四代了，虽然这个系统采用了旧的驱动系统，但是对
: 整个病毒蛋白的编码区做了进一步的split，并引入了tet调控，所以，应该是更安全一
: 些。但是共转染7个质粒的效率，显然不如三个。所以，第二代系统仍然是titer最高的
: 最有效的系统。
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n********k
发帖数: 2818 | 11 no, it seems u need to do a better homework:))...the packing systems for
lenti and retro are the same except lenti need one extra...the difference is
lenti vector has the bosai element which determine the nuclear import...
that's why lenti can infect both dividing and non-dividing cells...frankly,
I haven't seen any retro which doesn't infect non-dividing at all...
【在 s******y 的大作中提到】
: 手头上有一堆retroviral vector (pBabe and pQC, PsR, etc.) 一直都是
: 用retroviral packaging system (GAG/PoL + VsvG)
: 最近想用lentiviral system,以前从来没有用过，所以想问一个白痴问题，
: 就是能不能直接用以前的vector装到lentiviral packaging system里面?
: 随便看了看lentiviral 的说明书，貌似好像没有问题？
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i*****i
发帖数: 154 | 12 第二点，在表达载体上，第二代表达载体采用野生型的 HIV的LTR，而第三代载体采用
了chimeric的LTR，所以你经常会看到第三代表达载体的LTR写成CMV/LTR或者RSV/LTR用
来表示这种杂合LTR结构。
无论是lenti还是retro，LTR都既是promoter又是enhancer，比较一下lenti和retro的
LTR差别还是非常大的。
其实我们试过，lenti的包装系统可以包装retro的，而retro的也能包装lenti的表达载
体，只是效率非常非常的低，没有实际的可操作的意义，还不如直接用pcDNA3.1感染呢。
lenti里的特殊结构
WPRE (Woodchuck
Posttranscriptional Regulatory Element) from the woodchuck hepatitis
virus, increases transgene expression.
cPPT (central Polypurine
Tract) from the HIV-1 integrase gene, increases the copy number of
lentivirus integrating into the host genome, thus increasing viral
titer.
WPRE and cPPT together produce at least a four-fold increase in
protein expression in most cell types, compared to other vectors that
do not contain these elements. |
l**********1
发帖数: 5204 | 13 还不把你楼上的叫inanxx 啥的招同济去
如其CNS 记录比你还多和还牛
要不你当二当家的 让她/他当大当家的得了
就像林冲刚上了梁山那会儿...
有这气魄吗?
is
,
【在 n********k 的大作中提到】
: no, it seems u need to do a better homework:))...the packing systems for
: lenti and retro are the same except lenti need one extra...the difference is
: lenti vector has the bosai element which determine the nuclear import...
: that's why lenti can infect both dividing and non-dividing cells...frankly,
: I haven't seen any retro which doesn't infect non-dividing at all...
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m******n
发帖数: 121 | 14 问一下，可以用rt-pcr测ltr的方法检测lenti的滴度吗？另外这个方法怎么样呀？主要
是我有一个lenti没有gfp，然后p24的试剂盒么又太贵，所以在考虑用rt-pcr测滴度。
。。。。 |
