j****x
发帖数: 1704 | 1 想构建一个单载体诱导表达系统single-vector Tet-inducible lentivector，类似
clonetech的Tet-One system（据称是目前唯一的商品化载体），但是手头的载体系统
都是基于Invitrogen的pLenti系列的，不太想再换clonetech的kit了。
不知道有没有人基于pLenti载体构建过这种single-vector Tet-on系统，或者知道是否
可以在Addgene上找到类似的质粒。理论上讲，合成Tet-one上个那段包含Tet-on-3G以
及pTRE3GS-MCS的cassette然后置换掉pLenti载体上相应的区域即可。如果有人有经验可
以指点，非常感谢！ |
j****x
发帖数: 1704 | 2 类似这个载体
验可
【在 j****x 的大作中提到】
: 想构建一个单载体诱导表达系统single-vector Tet-inducible lentivector，类似
: clonetech的Tet-One system（据称是目前唯一的商品化载体），但是手头的载体系统
: 都是基于Invitrogen的pLenti系列的，不太想再换clonetech的kit了。
: 不知道有没有人基于pLenti载体构建过这种single-vector Tet-on系统，或者知道是否
: 可以在Addgene上找到类似的质粒。理论上讲，合成Tet-one上个那段包含Tet-on-3G以
: 及pTRE3GS-MCS的cassette然后置换掉pLenti载体上相应的区域即可。如果有人有经验可
: 以指点，非常感谢！
|
a****d
发帖数: 1919 | 3 http://www.addgene.org/43914/
这个gateway vector行不？包装用三代的包装质粒就行，addgene上面有全部的包装系
统。
验可
【在 j****x 的大作中提到】
: 想构建一个单载体诱导表达系统single-vector Tet-inducible lentivector，类似
: clonetech的Tet-One system（据称是目前唯一的商品化载体），但是手头的载体系统
: 都是基于Invitrogen的pLenti系列的，不太想再换clonetech的kit了。
: 不知道有没有人基于pLenti载体构建过这种single-vector Tet-on系统，或者知道是否
: 可以在Addgene上找到类似的质粒。理论上讲，合成Tet-one上个那段包含Tet-on-3G以
: 及pTRE3GS-MCS的cassette然后置换掉pLenti载体上相应的区域即可。如果有人有经验可
: 以指点，非常感谢！
|
T****u
发帖数: 424 | 4 https://www.addgene.org/21915/
这个就是pLKO-tetON
据说因为Clonetech 抗议，改成了 Tet-pLKO-puro
不用谢，我叫雷锋。
验可
【在 j****x 的大作中提到】
: 想构建一个单载体诱导表达系统single-vector Tet-inducible lentivector，类似
: clonetech的Tet-One system（据称是目前唯一的商品化载体），但是手头的载体系统
: 都是基于Invitrogen的pLenti系列的，不太想再换clonetech的kit了。
: 不知道有没有人基于pLenti载体构建过这种single-vector Tet-on系统，或者知道是否
: 可以在Addgene上找到类似的质粒。理论上讲，合成Tet-one上个那段包含Tet-on-3G以
: 及pTRE3GS-MCS的cassette然后置换掉pLenti载体上相应的区域即可。如果有人有经验可
: 以指点，非常感谢！
|
Z******5
发帖数: 435 | 5 我最近也在为这事折腾呢。
我们最近买了pLKO-Tet-on，表达shRNA非常好用。整个载体10k多一点。插入shRNA后载
体也不会太大。
也考虑把这个载体promoter改成表达蛋白的，但是如果插入蛋白表达基因就会很大。最
近还在纠结中。 |
T****u
发帖数: 424 | 6 包装效率低
【在 Z******5 的大作中提到】
: 我最近也在为这事折腾呢。
: 我们最近买了pLKO-Tet-on，表达shRNA非常好用。整个载体10k多一点。插入shRNA后载
: 体也不会太大。
: 也考虑把这个载体promoter改成表达蛋白的，但是如果插入蛋白表达基因就会很大。最
: 近还在纠结中。
|
j****x
发帖数: 1704 | 7 多谢诸位！
查了下前面给出的Addgene上的载体，感觉不是特别合适（表达shRNA和mRNA有一个很关
键的差别），最后还是决定自己手动改造了。根据Clonetech的pLVX-TetOne载体合成一
段大约3kb的cassette，置换到pLenti载体的backbone上，不含插入gene的话大概是9kb
，这样表达2kb以下的ORF应该问题不大，更大的插入就像铁牛所说，要严重影响包装效
率了。 |
x*****e
发帖数: 309 | 8 Plasmid 20321: TetO-FUW-OSKM ， 我觉得这个挺好的，用ＰＣＲ替换ＯＳＫＭ成自己
要表达的蛋白，刚刚订了个，试试看。
【在 Z******5 的大作中提到】
: 我最近也在为这事折腾呢。
: 我们最近买了pLKO-Tet-on，表达shRNA非常好用。整个载体10k多一点。插入shRNA后载
: 体也不会太大。
: 也考虑把这个载体promoter改成表达蛋白的，但是如果插入蛋白表达基因就会很大。最
: 近还在纠结中。
|
m*****z
发帖数: 1451 | 9 all in one的lenti载体最致命的就是表达基因的长度有限，太长了会大大影响滴度。
【在 j****x 的大作中提到】
: 类似这个载体
:
: 验可
|
m*****z
发帖数: 1451 | 10 那个公司会给你合成TRE3G promoter啊？里面有7个TRE repeat，合成难度很大哦。
9kb
【在 j****x 的大作中提到】
: 多谢诸位！
: 查了下前面给出的Addgene上的载体，感觉不是特别合适（表达shRNA和mRNA有一个很关
: 键的差别），最后还是决定自己手动改造了。根据Clonetech的pLVX-TetOne载体合成一
: 段大约3kb的cassette，置换到pLenti载体的backbone上，不含插入gene的话大概是9kb
: ，这样表达2kb以下的ORF应该问题不大，更大的插入就像铁牛所说，要严重影响包装效
: 率了。
|
|
|
j****x
发帖数: 1704 | 11 你说的没错，这类载体的插入片段大小非常受限，一旦超过2.5kb就很难包装了，如果
把WPRE等其他非必需element删除的话，大致包装极限能到3.5kb的样子。
能合成复杂重复序列的公司还是有的，稍微贵点儿而已。
【在 m*****z 的大作中提到】
: 那个公司会给你合成TRE3G promoter啊？里面有7个TRE repeat，合成难度很大哦。
:
: 9kb
|
m*****z
发帖数: 1451 | 12 WPRE不是对表达量有影响吗？
删掉了差别大不大？内行的人来讲讲？？
【在 j****x 的大作中提到】
: 你说的没错，这类载体的插入片段大小非常受限，一旦超过2.5kb就很难包装了，如果
: 把WPRE等其他非必需element删除的话，大致包装极限能到3.5kb的样子。
: 能合成复杂重复序列的公司还是有的，稍微贵点儿而已。
|
s*********s
发帖数: 110 | 13 用Adeno
【在 j****x 的大作中提到】
: 你说的没错，这类载体的插入片段大小非常受限，一旦超过2.5kb就很难包装了，如果
: 把WPRE等其他非必需element删除的话，大致包装极限能到3.5kb的样子。
: 能合成复杂重复序列的公司还是有的，稍微贵点儿而已。
|
j****x
发帖数: 1704 | 14 对于Tet-one系统，WPRE本身就不是调控你的target gene的，而是放在了resistance
gene和Tet-on 3G的后面，这个有或没有显然就影响不大了。
【在 m*****z 的大作中提到】
: WPRE不是对表达量有影响吗？
: 删掉了差别大不大？内行的人来讲讲？？
|
m*****z
发帖数: 1451 | 15 的确是。不过我自己做的lenti vector把WPRE放在了target gene后面，目的就是想增
加表达量，所以才有此一问。看来还是留着比较好？600左右长的片段，加减也不会影
响滴度太多吧，我想
【在 j****x 的大作中提到】
: 对于Tet-one系统，WPRE本身就不是调控你的target gene的，而是放在了resistance
: gene和Tet-on 3G的后面，这个有或没有显然就影响不大了。
|
