W*********n
发帖数: 775 | 1 想在一个无脊椎动物（和果蝇比较近）中研究一个信号通路上的蛋白酶（通过被磷酸化
起作用）的功能。在细胞水平和个体水平上研究。
1）过量表达蛋白，
２）抑制蛋白表达，包括SiRNA干扰，ds-RNA干扰，Mopholino阻断表达，或者negative
-dominant overexpression
由于蛋白酶需要磷酸化后起作用，而在信息传递过程被磷酸化的蛋白总是一小部分，觉
得即使蛋白水平上有一些变化，在磷酸化水平上变化也不大。那么用什么方法，能够更
容易看到变化呢？
请做过的朋友发表一下意见，那种方法比较好？ |
w********r
发帖数: 1431 | 2 其实RNAi的结果基本就能说明问题了。过表达的话可以在磷酸化位点做突变。类似于激
酶里的E或者D突变，或DN |
s******r
发帖数: 2876 | 3 有没有constitutive active mutant，可以overexpression.
negative
【在 W*********n 的大作中提到】
: 想在一个无脊椎动物（和果蝇比较近）中研究一个信号通路上的蛋白酶（通过被磷酸化
: 起作用）的功能。在细胞水平和个体水平上研究。
: 1）过量表达蛋白，
: ２）抑制蛋白表达，包括SiRNA干扰，ds-RNA干扰，Mopholino阻断表达，或者negative
: -dominant overexpression
: 由于蛋白酶需要磷酸化后起作用，而在信息传递过程被磷酸化的蛋白总是一小部分，觉
: 得即使蛋白水平上有一些变化，在磷酸化水平上变化也不大。那么用什么方法，能够更
: 容易看到变化呢？
: 请做过的朋友发表一下意见，那种方法比较好？
|
K**4
发帖数: 1015 | 4 把蛋白酶的活性氨基酸突变了
negative
【在 W*********n 的大作中提到】
: 想在一个无脊椎动物（和果蝇比较近）中研究一个信号通路上的蛋白酶（通过被磷酸化
: 起作用）的功能。在细胞水平和个体水平上研究。
: 1）过量表达蛋白，
: ２）抑制蛋白表达，包括SiRNA干扰，ds-RNA干扰，Mopholino阻断表达，或者negative
: -dominant overexpression
: 由于蛋白酶需要磷酸化后起作用，而在信息传递过程被磷酸化的蛋白总是一小部分，觉
: 得即使蛋白水平上有一些变化，在磷酸化水平上变化也不大。那么用什么方法，能够更
: 容易看到变化呢？
: 请做过的朋友发表一下意见，那种方法比较好？
|
W*********n
发帖数: 775 | 5 RNAi不是有脱靶的问题吗？ 以前没有做过，所以对这个问题是否严重没有很好的把握
。这个蛋白的磷酸化位点不能突变成模拟磷酸化的蛋白，所以这条道路不通。
【在 w********r 的大作中提到】
: 其实RNAi的结果基本就能说明问题了。过表达的话可以在磷酸化位点做突变。类似于激
: 酶里的E或者D突变，或DN
|
W*********n
发帖数: 775 | 6 您是说突变体的生物个体吗？还是插入质粒用来过表达组成性的,失去功能的蛋白？
【在 s******r 的大作中提到】
: 有没有constitutive active mutant，可以overexpression.
:
: negative
|
W*********n
发帖数: 775 | 7 您是说生成突变体的生物个体？还是通过质粒过量表达突变了活性氨基酸的蛋白？
【在 K**4 的大作中提到】
: 把蛋白酶的活性氨基酸突变了
:
: negative
|
w********r
发帖数: 1431 | 8 通常认为RNAi结果比过表达可靠。
用多条siRNA，再用cDNA rescue可以证明看到的表型是否是脱靶导致 |
K**4
发帖数: 1015 | 9 生成突变体的生物个体
如果有条件的话
【在 W*********n 的大作中提到】
: 您是说生成突变体的生物个体？还是通过质粒过量表达突变了活性氨基酸的蛋白？
|
l**********1
发帖数: 5204 | 10 LZ can try long hairpin RNAi
Reference:
Tomimoto K et al. (2012)
Construction of a long hairpin RNA expression library using Cre recombinase.
J Biotechnol. 160: 129-39.
PubMed link:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22484114
发信人: Wanshington (Joudon), 信区: Biology
标 题: Re: 讨论：信号通路上的蛋白酶功能研究策略哪种好？
发信站: BBS 未名空间站 (Fri Sep 28 03:33:37 2012, 美东)
RNAi不是有脱靶的问题吗？ 以前没有做过，所以对这个问题是否严重没有很好的把握
。这个蛋白的磷酸化位点不能突变成模拟磷酸化的蛋白，所以这条道路不通。
【在 w********r 的大作中提到】
: 其实RNAi的结果基本就能说明问题了。过表达的话可以在磷酸化位点做突变。类似于激
: 酶里的E或者D突变，或DN
|
