j*****q
发帖数: 82 | 1 sybr green的方法。primer express设计的引物， 没hairpin，没dimer，在载体上扩
增很漂亮，线性化也很好。但是拿到基因组DNA上扩增就很差。 不同的底物浓度的ct值
很接近，而且都偏大，28，29的水平。
这样的现象能是什么问题呢？引物本身的问题吗？
多谢了 |
s******y
发帖数: 28562 | 2 首先，你设计的时候考虑到了基因组上的intron 了么？
第二，一般来说，基因组做底物很麻烦的，一个是量的问题，第二就是特异性的问题。
所以很少有人这么做。
但是如果非要这么做不可的话，必须放很大量进去（你自己算算摩尔数，要放到和你放
的plasmid 差不多的量得放多少，不要盲目用ug 这些重量单位，那个不算数的）
【在 j*****q 的大作中提到】
: sybr green的方法。primer express设计的引物， 没hairpin，没dimer，在载体上扩
: 增很漂亮，线性化也很好。但是拿到基因组DNA上扩增就很差。 不同的底物浓度的ct值
: 很接近，而且都偏大，28，29的水平。
: 这样的现象能是什么问题呢？引物本身的问题吗？
: 多谢了
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j*****q
发帖数: 82 | 3 偶是定量copy number，用的直接是gDNA做template。所以没有intron的问题。
而且做的相对定量，所以底物的量不是问题，底物会有一个剃度的。
还是谢谢阳光jj的回帖。 |
A******y
发帖数: 2041 | 4 You need new primer, I think. Plasmid is super-coiled, the linearity might
not be the same for linear DNA. |
c******r
发帖数: 3778 | 5 怎么提的dna？
【在 j*****q 的大作中提到】
: 偶是定量copy number，用的直接是gDNA做template。所以没有intron的问题。
: 而且做的相对定量，所以底物的量不是问题，底物会有一个剃度的。
: 还是谢谢阳光jj的回帖。
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j*****q
发帖数: 82 | 6
might
确实是。一样的底物，换了一组primer就work了。但是其他几个target，试到现在的
primer pair都不work。按理按照那些规则来设计的primer，应该没问题啊。难道只有
不停的试？
【在 A******y 的大作中提到】
: You need new primer, I think. Plasmid is super-coiled, the linearity might
: not be the same for linear DNA.
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j*****q
发帖数: 82 | 7
qiagen kit
【在 c******r 的大作中提到】
: 怎么提的dna？
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H****N
发帖数: 997 | 8 Its likely your primers are not good. They work on your plasmid because the
coplexity of your plasmid is very low. The genome is many orders higher in
complexity. Try to redesign your primers by avoiding repeats and having high
specificity. It would be much easier if your applicon is smaller than 300
bp. |
A******y
发帖数: 2041 | 9 Try primer bank,
http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/
【在 j*****q 的大作中提到】
:
: qiagen kit
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c******r
发帖数: 3778 | 10 用什么东西溶解的DNA？
plasmid用什么东西溶解的？
【在 j*****q 的大作中提到】
:
: qiagen kit
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j*****q
发帖数: 82 | 11 plasimd DNA和genomic DNA都是用水溶解的。
后来又试了taqman的probe和primer，还是一样。但是另一个项目就work的，很奇怪啊
。继续求助！ |
s******y
发帖数: 28562 | 12 应该就是有杂带了。用质粒的时候因为背景低，所以杂带不明显，主带就可以
比较容易的扩出来。用基因组的时候正好相反。因为基因组里的序列太复杂，
你设计的那个primer有可能对其他地方也有partial match, 结果就是弄出了
好几种产物，大部分都不能集中的被扩出来。
我以前遇到过类似情况，要么就是提高annealing temperature （我最高的时候
用过66度），要么就是彻底放弃原来的primer, 从头设计另外几个。
【在 j*****q 的大作中提到】
: plasimd DNA和genomic DNA都是用水溶解的。
: 后来又试了taqman的probe和primer，还是一样。但是另一个项目就work的，很奇怪啊
: 。继续求助！
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s******y
发帖数: 28562 | 13 对，大概就是这个问题。
the
high
【在 H****N 的大作中提到】
: Its likely your primers are not good. They work on your plasmid because the
: coplexity of your plasmid is very low. The genome is many orders higher in
: complexity. Try to redesign your primers by avoiding repeats and having high
: specificity. It would be much easier if your applicon is smaller than 300
: bp.
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j*****q
发帖数: 82 | 14 设计的primer的annealing temperature都是58度多，如果提太高，是不是连primer都
aneal不上去了？ |
s******y
发帖数: 28562 | 15 亲自试一次就知道了。
大部分都没有问题的。
【在 j*****q 的大作中提到】
: 设计的primer的annealing temperature都是58度多，如果提太高，是不是连primer都
: aneal不上去了？
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j****x
发帖数: 1704 | 16 NCBI的primer tool里一试便知
www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/Share
最近集中设计了几十对类似引物，我的感觉是，想整出没有非特异性结合/扩增的gDNA
primer，那几乎就是不可能啊
【在 s******y 的大作中提到】
: 应该就是有杂带了。用质粒的时候因为背景低，所以杂带不明显，主带就可以
: 比较容易的扩出来。用基因组的时候正好相反。因为基因组里的序列太复杂，
: 你设计的那个primer有可能对其他地方也有partial match, 结果就是弄出了
: 好几种产物，大部分都不能集中的被扩出来。
: 我以前遇到过类似情况，要么就是提高annealing temperature （我最高的时候
: 用过66度），要么就是彻底放弃原来的primer, 从头设计另外几个。
|
a******a
发帖数: 283 | 17 ask a question in this thread: regarding genomic DNA purification. I will be
doing about the same project -- qPCR genomic DNA for the amount of gene
inserts after transfecting the cells with retroviral vectors.
My plan is to transfect the cell culture on day 1; then on day3, harvest
cells and collect genomic DNA. at this point, how to eliminate the plasmids
present in the cells (if there is still any left without incorporating in
the genome)? would centrifugation alone enough to get rid of most plasmid?
Thanks for your input. |
h******y
发帖数: 351 | 18 No, centrifugation will not separate plasmid DNA from genomic DNA.
be
plasmids
【在 a******a 的大作中提到】
: ask a question in this thread: regarding genomic DNA purification. I will be
: doing about the same project -- qPCR genomic DNA for the amount of gene
: inserts after transfecting the cells with retroviral vectors.
: My plan is to transfect the cell culture on day 1; then on day3, harvest
: cells and collect genomic DNA. at this point, how to eliminate the plasmids
: present in the cells (if there is still any left without incorporating in
: the genome)? would centrifugation alone enough to get rid of most plasmid?
: Thanks for your input.
|
j*****q
发帖数: 82 | 19
gDNA
这个能用已有的primer pair来找在template上的非特异性结合？
可是偶的template还没有全基因组序列呢。不是human，也不是mouse。
其实有特异性结合扩增问题不大的，因为probe也是specific的。
【在 j****x 的大作中提到】
: NCBI的primer tool里一试便知
: www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/Share
: 最近集中设计了几十对类似引物，我的感觉是，想整出没有非特异性结合/扩增的gDNA
: primer，那几乎就是不可能啊
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j*****q
发帖数: 82 | 20
今天试了60，62，64，66度anealing，跑了普通pcr，温度越高，条带越弱，而且没有
杂带。
真是奇怪啊。难不成copy number就是这么低？
【在 s******y 的大作中提到】
: 亲自试一次就知道了。
: 大部分都没有问题的。
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s******y
发帖数: 28562 | 21 当然是温度越高条带越弱啊，但是如果你换了温度就必须重新做标准曲线，
不能用你以前的那个曲线来算copy number.
换一句话来说，同样数目的template, annealing temperature 越高，出来的
产物越少。这个是PCR的基本常识啊。
【在 j*****q 的大作中提到】
:
: 今天试了60，62，64，66度anealing，跑了普通pcr，温度越高，条带越弱，而且没有
: 杂带。
: 真是奇怪啊。难不成copy number就是这么低？
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a******a
发帖数: 283 | 22 Thanks for the input. Is there any other methods? I read one paper (the
nature paper 2002) by K. Cornetta but they didn't specify how they prepare
their genomic DNA.
【在 h******y 的大作中提到】
: No, centrifugation will not separate plasmid DNA from genomic DNA.
:
: be
: plasmids
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a******a
发帖数: 283 | 23 I have one question that's really baffling me. I have a set of primers, only
gave good efficiency and good amplification signals when primer
concentrations at 2.5uM (working concentration!!! triple checked), annealing
temperature at 63.8C (while the Tm for the primers are 54.6C and 55.8C).
Anyone can explain at all?
【在 s******y 的大作中提到】
: 当然是温度越高条带越弱啊，但是如果你换了温度就必须重新做标准曲线，
: 不能用你以前的那个曲线来算copy number.
: 换一句话来说，同样数目的template, annealing temperature 越高，出来的
: 产物越少。这个是PCR的基本常识啊。
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G*****h
发帖数: 320 | 24 如果primers 的特异性很好，没有杂带，没有intons，那么很可能就是target gene 本
身的拷贝数就很低。
如果物种的 genome 已经测序过的，可以看看这个基因的拷贝数。也可以算一下一个细
胞的 DNA 大概是多少 DNA，然后算算你放进去的DNA的量可以折算成几个拷贝。
一般1个bp 大概 10^(-9) pg。1 Mb gDNA ～1 fg。如果一套基因组大小是 1 GB，那么
～1000 fg ＝ ～1 pg。如果你放了 10 ng，单拷贝的基因就是 10^4 拷贝。
当然 genome PCR 的条件也需要 optimized。比如先要 95 C denature 5 min，前面的
一些 cycles 的annealing 和 extension 的时间长些，等等。
再就是根据你 amplify plasmid的结果（slope），看看你的 PCR amplification 的
efficiency。如果 efficiency 很低，那么大genome 里面的低拷贝的基因就更需要多
个 cycles。 |
j*****q
发帖数: 82 | 25 继续来问问题。
threshold的那跟线是可以调的。那target和reference一起调的时候原则是什么呢？
我两个都调了一下，发现跟原始的计算下来还是有差距的，虽然是deltadeltaCt的值。
这个以什么为准呢。
多谢 |
G*****h
发帖数: 320 | 26 Real-time PCR 的Ct 本身是特指刚能够测到信号时，需要的 cycle 数。这个cycles
数 和原始样本的量的“对数”成线性关系。当你调节 threshold 的时候，离本底越远
，也就离线性关系越远。到最后大家都饱和了，就和普通 PCR 跑胶一样了。当然，在
理想情况下，“稍微”离开一点，对线性关系的影响应该不大。但这时候，软件找到的
应该是最佳的。
如果反应不理想，比如本底比较强，或者信号上升曲线不理想，最好的方法是把
reaction optimized。实在要自己调的时候，一般是本底杂信号高的时候（左边本来应
该低于 threshold 的信号有时候会超过 threshold），你估计可以稍微调节一下
threshold 到刚好超过背景信号的地方。尽量不要离开太远，否则会导致离开线性关系
太远。
顺便介绍一下第二个方式（F0）：
除了Ct的方式，还有如果上升曲线很好，也可以用一个算 F0 的方式。也就是通过非线
性回归（Sigmoidal）计算样本没有放大的时候的应该有的原始荧光强度（F0 ＝cycle
为 0 的时候的 fluorescence 强度）。这个方法的优点是可以把不同的 genes（很可
能有不同 efficiencies）的信号直接互相比较，这个在比较多个基因的时候很有用。
因为这是的信号是原始信号，和 PCR efficiency 没有关系了。而用Ct 的方法比较几
个基因时，它们的 efficiencies 必须一样才成立。
【在 j*****q 的大作中提到】
: 继续来问问题。
: threshold的那跟线是可以调的。那target和reference一起调的时候原则是什么呢？
: 我两个都调了一下，发现跟原始的计算下来还是有差距的，虽然是deltadeltaCt的值。
: 这个以什么为准呢。
: 多谢
|
j*****q
发帖数: 82 | 27 谢谢ls的大大指教。
我正是因为threhold离的baseline太远了，所以才调的，但是调起来要么看standard
curve，要么看triplicate的std值要小。因为没有办法解决的原因，我没standard的，
所以没有标准曲线， 而且我是做genomic DNA的template，我现在的方法是拿genomic
DNA template来做个剃度，如果每个浓度下的ct值的std很小，那我就认为是过关的。
但也不是每个实验都能做出能接受的结果来。所以很郁闷啊。 |
C*******e
发帖数: 4348 | 28 +1
还可以做2step的
aneal和amplify都在60度
primer melting temp在55-60之间的都没问题
【在 s******y 的大作中提到】
: 应该就是有杂带了。用质粒的时候因为背景低，所以杂带不明显，主带就可以
: 比较容易的扩出来。用基因组的时候正好相反。因为基因组里的序列太复杂，
: 你设计的那个primer有可能对其他地方也有partial match, 结果就是弄出了
: 好几种产物，大部分都不能集中的被扩出来。
: 我以前遇到过类似情况，要么就是提高annealing temperature （我最高的时候
: 用过66度），要么就是彻底放弃原来的primer, 从头设计另外几个。
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C*******e
发帖数: 4348 | 29 “但是拿到基因组DNA上扩增就很差。 不同的底物浓度的ct值
很接近，而且都偏大”
——除了上面这么多id说的，
另外还有一个情况要注意，gDNA提取过程中很多时候会带有PCR inhibitor
有的是样品带来的（比如environmental sample可能含humic acids， polyphenols
），有的是提纯过程中引入的（比如EtOH去的不干净之类的）
所以不是模板越多就越该P出来的
很多时候稀释模板以后反而能够P出来就是这个道理
因为稀释的时候PCR inhibitor也被稀释了
你这个“不同第五浓度Ct值很接近，而且都偏大”可能就是这个因素
【在 j*****q 的大作中提到】
: sybr green的方法。primer express设计的引物， 没hairpin，没dimer，在载体上扩
: 增很漂亮，线性化也很好。但是拿到基因组DNA上扩增就很差。 不同的底物浓度的ct值
: 很接近，而且都偏大，28，29的水平。
: 这样的现象能是什么问题呢？引物本身的问题吗？
: 多谢了
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