y*****0
发帖数: 15 | 1 最近在做genomic DNA的PCR，用的Tm 60Co, Herculase2 DNA polymerase
40uL PCR reaction，全是文章里的条件。但做出来的band总是模模糊糊的，不sharp。
不知道有什么办法可以改进这个PCR？万分感谢！ |
s******y
发帖数: 17729 | 2 直接quit了算了
还有比做PCR更简单的活儿吗？
【在 y*****0 的大作中提到】
: 最近在做genomic DNA的PCR，用的Tm 60Co, Herculase2 DNA polymerase
: 40uL PCR reaction，全是文章里的条件。但做出来的band总是模模糊糊的，不sharp。
: 不知道有什么办法可以改进这个PCR？万分感谢！
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i***l
发帖数: 1656 | 3 同意，这也看天赋的。你这么问， 的确显示的很不具PCR天赋.
【在 s******y 的大作中提到】
: 直接quit了算了
: 还有比做PCR更简单的活儿吗？
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s******y
发帖数: 17729 | 4 做个烂PCR也跟天赋扯上了，提质粒是不是也是天赋啊，廓狐还是kit提哦
难怪人说学生物的笨
【在 i***l 的大作中提到】
: 同意，这也看天赋的。你这么问， 的确显示的很不具PCR天赋.
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i***l
发帖数: 1656 | 5 呵呵
随便
【在 s******y 的大作中提到】
: 做个烂PCR也跟天赋扯上了，提质粒是不是也是天赋啊，廓狐还是kit提哦
: 难怪人说学生物的笨
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l********e
发帖数: 415 | 6 用这个，百试不爽
http://www.qiagen.com/products/catalog/assay-technologies/end-p
【在 y*****0 的大作中提到】
: 最近在做genomic DNA的PCR，用的Tm 60Co, Herculase2 DNA polymerase
: 40uL PCR reaction，全是文章里的条件。但做出来的band总是模模糊糊的，不sharp。
: 不知道有什么办法可以改进这个PCR？万分感谢！
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x********e
发帖数: 35261 | 7 PCR是要看基因的吧，不是每个基因都好p，特别是gDNA
【在 s******y 的大作中提到】
: 直接quit了算了
: 还有比做PCR更简单的活儿吗？
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Z******5
发帖数: 435 | 8 可以出band，但比较模糊的情况下，可以考虑试一下touchdown |
j****n
发帖数: 3370 | 9 试过常规的optimization没，例如退火温度，可以做个gradient试试或者touchdown
还是不行的话，可以考虑换enzyme或者buffer
推荐epicentre的FailSafe™ PCR PreMix Selection Kit
有12种不同离子强度的buffer 从适合高AT的A buffer到适合高GC的L buffer
对于某些特殊的基因，只有某一种或两种buffer好用 其他的都不行 |
s*****i
发帖数: 315 | 10 + 10% 5M betain 试试，sigma有卖
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.7
【在 y*****0 的大作中提到】
: 最近在做genomic DNA的PCR，用的Tm 60Co, Herculase2 DNA polymerase
: 40uL PCR reaction，全是文章里的条件。但做出来的band总是模模糊糊的，不sharp。
: 不知道有什么办法可以改进这个PCR？万分感谢！
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y*****0
发帖数: 15 | 11 谢谢各位牛人啦！
【在 s*****i 的大作中提到】
: + 10% 5M betain 试试，sigma有卖
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: ★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.7
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x*******t
发帖数: 3764 | 12 加2ul的DMSO试试，或者用GC buffer
【在 y*****0 的大作中提到】
: 最近在做genomic DNA的PCR，用的Tm 60Co, Herculase2 DNA polymerase
: 40uL PCR reaction，全是文章里的条件。但做出来的band总是模模糊糊的，不sharp。
: 不知道有什么办法可以改进这个PCR？万分感谢！
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y*****0
发帖数: 15 | 13 已经试过DMSO了，没有什么帮助。也听说betain对GC rich的gDNA PCR有帮助，正准备
试试。其实这个PCR还真不是一般的PCR，是用CRISPR／Cas library lentivirus 感染
后，用PCR扩增integrated gRNA，难度很大啊。谁做过这个screen，可以交流一下。万
分谢谢！
【在 x*******t 的大作中提到】
: 加2ul的DMSO试试，或者用GC buffer
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m*********D
发帖数: 1727 | 14 好多年不作PCR了。上个月也是作genomic PCR,才两三KB，也碰到了同样问题。后来用
NEB的Q5 polymerase加GC enhancer解决。你试试？ |
l********e
发帖数: 415 | 15 有什么区别么，不就是一个transgene
【在 y*****0 的大作中提到】
: 已经试过DMSO了，没有什么帮助。也听说betain对GC rich的gDNA PCR有帮助，正准备
: 试试。其实这个PCR还真不是一般的PCR，是用CRISPR／Cas library lentivirus 感染
: 后，用PCR扩增integrated gRNA，难度很大啊。谁做过这个screen，可以交流一下。万
: 分谢谢！
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t**l
发帖数: 109 | |
n********k
发帖数: 2818 | 17 别理他们，你这个难度估计有哈；不过这种文库的东东BAND应该SHARP吗？
如果从纯优化PCR条件而言，现在完全不值得自己优化条件，换酶，换引物，换体系等
远比优化来的方便；如果是比较特殊的PCR，那一开始就要考虑到选对几个备选的PCR扩
增体系。这些都考虑到了，还需要自己优化的，那就要有对PCR的深入了解和经验了，
建议在周围找一个这样的“牛"人,详细讨论了。
【在 y*****0 的大作中提到】
: 最近在做genomic DNA的PCR，用的Tm 60Co, Herculase2 DNA polymerase
: 40uL PCR reaction，全是文章里的条件。但做出来的band总是模模糊糊的，不sharp。
: 不知道有什么办法可以改进这个PCR？万分感谢！
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m*****u
发帖数: 15526 | 18 genome太大，非特异杂交几率很高，用hotstart PCR。 |
