j**********0
发帖数: 391 | 1 要检测病人中某个基因有无突变，8kb，100个case。计划用常规测序方法，但我有一个
问题。
如果是突变是杂合子，那PCR扩增的模板是随机的，有可能扩增出来正常的，可有可能
扩增出来突变的那条链，那测序的时候怎么能区分出来呢？
多谢。 |
s******s
发帖数: 13035 | 2 扩增出来两种同时存在。需要肉眼看图，或者找找有没有专门的软件
【在 j**********0 的大作中提到】
: 要检测病人中某个基因有无突变，8kb，100个case。计划用常规测序方法，但我有一个
: 问题。
: 如果是突变是杂合子，那PCR扩增的模板是随机的，有可能扩增出来正常的，可有可能
: 扩增出来突变的那条链，那测序的时候怎么能区分出来呢？
: 多谢。
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j**********0
发帖数: 391 | 3 那工作量太大了，而且效率低，8kb，100个case。还有好办法吗？
【在 s******s 的大作中提到】
: 扩增出来两种同时存在。需要肉眼看图，或者找找有没有专门的软件
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l******o
发帖数: 62 | 4 问题是当两个ratio差别大的时候, 肉眼也看不出来.
可以克隆到载体上, 随机挑10个, 分别测序.我以前就这么做过. |
j**********0
发帖数: 391 | 5 也不是好办法，工作量太大。还有什么方法吗？
【在 l******o 的大作中提到】
: 问题是当两个ratio差别大的时候, 肉眼也看不出来.
: 可以克隆到载体上, 随机挑10个, 分别测序.我以前就这么做过.
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s******s
发帖数: 13035 | 6 叫你找软件了。
btw，也就1000个序列，你搞sample，PCR, 检测产物，
测序都做了，最容易的一步就是看了，工作量大个头啊。
【在 j**********0 的大作中提到】
: 那工作量太大了，而且效率低，8kb，100个case。还有好办法吗？
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s******s
发帖数: 13035 | 7 怎么可能ratio差别大，不是Homo就是hetero，
就是1:0和1:1的区别，还有其他ratio?
你挑个10个，就是1000个变成10000个了，太恐怖。
其实如果实验室老是有这样的sample,倒是容易了，
直接打碎了，加不一样的barcode，去NGS。省力点的，
估计一下突变率，用点数学，组合一下code，我估计
24plex一类一个run的就能把100个全测了。
【在 l******o 的大作中提到】
: 问题是当两个ratio差别大的时候, 肉眼也看不出来.
: 可以克隆到载体上, 随机挑10个, 分别测序.我以前就这么做过.
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G***y
发帖数: 1082 | 8 You can directly sequnence the PCR product (mixture of both).
【在 j**********0 的大作中提到】
: 要检测病人中某个基因有无突变，8kb，100个case。计划用常规测序方法，但我有一个
: 问题。
: 如果是突变是杂合子，那PCR扩增的模板是随机的，有可能扩增出来正常的，可有可能
: 扩增出来突变的那条链，那测序的时候怎么能区分出来呢？
: 多谢。
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l**********1
发帖数: 5204 | 9 Bingo
plus NGS SNP Bioinformatics platform:
i.e:
http://www.snps3d.org/
more try,
HTTP: //www.snps3d.org/modules.php?name=Go
HTTP: //www.snps3d.org/modules.php?name=Browser
HTTP: //www.snps3d.org/modules.php?name=SNPtargets
HTTP: //www.snps3d.org/modules.php?name=BrowserAll&id=A
from
Valencia A et al. (2012)
Getting personalized cancer genome analysis into
the clinic: the challenges in bioinformatics
Genome Med.4: 61.
web link.
HTTP ://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22839973
【在 G***y 的大作中提到】
: You can directly sequnence the PCR product (mixture of both).
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f*******2
发帖数: 14 | 10 Recommend using PacBio sequencer. multiplex all 100 cases with barcodes, PCR
amplify the whole 8Kb. A single smrt cell can generate enough sequence data
for the mutation detection. better than regular Sanger sequencing.
Contact me if you need more info.
【在 j**********0 的大作中提到】
: 要检测病人中某个基因有无突变，8kb，100个case。计划用常规测序方法，但我有一个
: 问题。
: 如果是突变是杂合子，那PCR扩增的模板是随机的，有可能扩增出来正常的，可有可能
: 扩增出来突变的那条链，那测序的时候怎么能区分出来呢？
: 多谢。
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s******s
发帖数: 13035 | 11 要求科普。pacbio的multiplex这么容易做么？
PCR
data
【在 f*******2 的大作中提到】
: Recommend using PacBio sequencer. multiplex all 100 cases with barcodes, PCR
: amplify the whole 8Kb. A single smrt cell can generate enough sequence data
: for the mutation detection. better than regular Sanger sequencing.
: Contact me if you need more info.
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j****x
发帖数: 1704 | 12 同求科普，关键是成本
【在 s******s 的大作中提到】
: 要求科普。pacbio的multiplex这么容易做么？
:
: PCR
: data
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f*******2
发帖数: 14 | 13 对于LZ的项目，用PacBio的成本要比Sanger sequencing少。
multiplex是在PCR step. Barcodes can be added at the 5' end of both forward
and reverse primers for each sample. After PCR, purify and pool the
amplicons together with equal amount. Making one PacBio library with the
pooled sample and run one SMRT cell. Total price about 500 for PacBio
sequencing. The total throughput is about 100Mb per smrt cell with about 20-
50K reads.
LZ的200个PCR pool, 每个至少有100x coverage. 应该可以检测到50% or 100%突变.
【在 j****x 的大作中提到】
: 同求科普，关键是成本
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s******s
发帖数: 13035 | 14 我还以为你这个比其他ngs的multiplex简单多了呢。看上去还是差不多。
你这个要订200对完全不同的PCR引物做PCR并且纯化，不太靠谱。
我前面说过了，除非一直有这样的sample做，否则multiplex就是自己找麻烦
20-
【在 f*******2 的大作中提到】
: 对于LZ的项目，用PacBio的成本要比Sanger sequencing少。
: multiplex是在PCR step. Barcodes can be added at the 5' end of both forward
: and reverse primers for each sample. After PCR, purify and pool the
: amplicons together with equal amount. Making one PacBio library with the
: pooled sample and run one SMRT cell. Total price about 500 for PacBio
: sequencing. The total throughput is about 100Mb per smrt cell with about 20-
: 50K reads.
: LZ的200个PCR pool, 每个至少有100x coverage. 应该可以检测到50% or 100%突变.
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f*******2
发帖数: 14 | 15 要用NGS，估计还真没什么比这更简单的multiplex方法。比常规PCR后sanger
sequencing优势主要在throughput。样本量大当然就更合适了。再一个，如果突变率低
，Sanger direct sequencing PCR products很难检测到。
【在 s******s 的大作中提到】
: 我还以为你这个比其他ngs的multiplex简单多了呢。看上去还是差不多。
: 你这个要订200对完全不同的PCR引物做PCR并且纯化，不太靠谱。
: 我前面说过了，除非一直有这样的sample做，否则multiplex就是自己找麻烦
:
: 20-
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f*******2
发帖数: 14 | 16 再有就是PacBio的reads比较长，现阶段平均5kb. LZ 的每个样本一个PCR片断就可以了
。常规测序的分几个PCR吧。每个都得单独测。
总有麻烦的地方。
【在 s******s 的大作中提到】
: 我还以为你这个比其他ngs的multiplex简单多了呢。看上去还是差不多。
: 你这个要订200对完全不同的PCR引物做PCR并且纯化，不太靠谱。
: 我前面说过了，除非一直有这样的sample做，否则multiplex就是自己找麻烦
:
: 20-
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s******s
发帖数: 13035 | 17 常规测序只要一个pcr，测序的时候引物不一样就可以了，当然8k不好批。
这种multiplex我也用过，觉得比这个情况更合适。当时是检测三种状况
下十几个基因甲基化情况。甲基化一般每段都要是克隆测序，比较烦，但是
同时不关心具体是哪个克隆。所以，我的做法是，每个基因选个两三段pcr
出来，混一起，然后用某种dnase打成小片段，然后每种状况加一个barcode,
最后就只是triplex。
【在 f*******2 的大作中提到】
: 再有就是PacBio的reads比较长，现阶段平均5kb. LZ 的每个样本一个PCR片断就可以了
: 。常规测序的分几个PCR吧。每个都得单独测。
: 总有麻烦的地方。
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N****n
发帖数: 294 | 18 PacBio Sales Start to Pick Up as Company Delivers on Product Enhancements
What enhancements did they put up? Any comments?
【在 f*******2 的大作中提到】
: 再有就是PacBio的reads比较长，现阶段平均5kb. LZ 的每个样本一个PCR片断就可以了
: 。常规测序的分几个PCR吧。每个都得单独测。
: 总有麻烦的地方。
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f*******2
发帖数: 14 | 19 主要有三个方面的改进：
1。硬件上光学系统，升级后可以同时检测15万 ZMWs，通量增加俩倍:200-500Mb per
smrt cell
2。更好的DNA Polymerase，可以跑最长两个小时，增加了average read length up to
5Kb.
3。分析软件的更新，可以只用PAcBio data for de novo assembly, targeted
resequencing for variants detection and DNA modification detection.
【在 N****n 的大作中提到】
: PacBio Sales Start to Pick Up as Company Delivers on Product Enhancements
: What enhancements did they put up? Any comments?
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t*m
发帖数: 4414 | 20 pcr (difficult), paired end ngs, phase haplotype
【在 j**********0 的大作中提到】
: 要检测病人中某个基因有无突变，8kb，100个case。计划用常规测序方法，但我有一个
: 问题。
: 如果是突变是杂合子，那PCR扩增的模板是随机的，有可能扩增出来正常的，可有可能
: 扩增出来突变的那条链，那测序的时候怎么能区分出来呢？
: 多谢。
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