d****i
发帖数: 2346 | 1 我们使用的是荧光二抗，就是licor的那个，不是HRP，做某蛋白的磷酸化分析，
western。
问题一，一般是先上磷酸化抗体，strip之后再上total抗体，但是这种二抗strip掉信
号很困难，大家有什么好办法？
问题二，western里有磷酸化抗体的信号，total蛋白的信号，还有actin的信号，怎么
计算磷酸化信号的强弱？
谢谢！ |
g*********5
发帖数: 2533 | 2 strip with odyssey stripping buffer. I had pasted one protocol for it
several month ago. |
d****i
发帖数: 2346 | 3
能给个link吗？谢谢！
【在 g*********5 的大作中提到】
: strip with odyssey stripping buffer. I had pasted one protocol for it
: several month ago.
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m***0
发帖数: 7 | 4 为什么不直接用不同颜色的荧光二抗，就不用strip了 |
d****i
发帖数: 2346 | 5
已有的2个抗体都是兔子的。。。。。。。
【在 m***0 的大作中提到】
: 为什么不直接用不同颜色的荧光二抗，就不用strip了
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d****u
发帖数: 275 | 6
跑个重复样品，一个P一个T；strip以后其实信号问题也很大；
难道你的total和actin的分子量一样大？
很多软件都可以western定量，如Image J，甚至大家鄙视的Photoshop，推荐用Image
Quant，特别是有大量条带要处理。
【在 d****i 的大作中提到】
: 我们使用的是荧光二抗，就是licor的那个，不是HRP，做某蛋白的磷酸化分析，
: western。
: 问题一，一般是先上磷酸化抗体，strip之后再上total抗体，但是这种二抗strip掉信
: 号很困难，大家有什么好办法？
: 问题二，western里有磷酸化抗体的信号，total蛋白的信号，还有actin的信号，怎么
: 计算磷酸化信号的强弱？
: 谢谢！
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l***y
发帖数: 4671 | 7 change pri antibodies...
【在 d****i 的大作中提到】
:
: 已有的2个抗体都是兔子的。。。。。。。
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l***y
发帖数: 4671 | 8 The imaging machine itself should provide some quantification tools.
Again, it's quantification, not digitalization. Standard curve/working curve
/dynamic range/cumulative exposure/transformation/normalization/
standardization/blah blah are highly recommended. If lz really wants
quantitative analysis of WB, do it correctly.
MD Anderson RPPA center has very good design of the quantification controls
using limited series diluting method and an acceptable "super curve"
approach. Both can be used for qWB.
【在 d****u 的大作中提到】
:
: 跑个重复样品，一个P一个T；strip以后其实信号问题也很大；
: 难道你的total和actin的分子量一样大？
: 很多软件都可以western定量，如Image J，甚至大家鄙视的Photoshop，推荐用Image
: Quant，特别是有大量条带要处理。
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