b**********8
发帖数: 349 | 1 这个问题快困扰我一年了，今天特意翻墙过来求助各位大大，
事情是这样的，之前在博士的实验室一直用pLKO.1-puro shRNA干扰基因表达，用的
invitrogen的包装质粒（PLP1，PLP2和VSVG），在10cm的dish里面用HEK293FT转染，转
染用的是磷酸钙沉淀法，病毒上清用SBI的 precipitation solution（5x）浓缩，一直
都work well，偶尔偷懒奢侈一把用lipo2000转染，效率也是没得说。自去年博士毕业
回国后来到现在这个小实验室，当时雄心勃勃自信满满，打算自己包装慢病毒，用的还
是跟之前一样的质粒，细胞，只不过换到了T75的flask里面，用lipo2000转染（磷酸钙
转染法配buffer太烦，实验室pH计不准，老板对经费管的也很松，哈哈），之后用同样
的方法收病毒上清，浓缩。感染细胞后加puromycin筛选，染毒的细胞都能活下来，而
对照细胞48小时候就死光。可是收集细胞蛋白做WB却一点都看不到knockdown，前前后
后重复好几回了，都是一样的结果，现在无奈把这一块交给公司做了，但是自己还是不
死心，今天写出来问问大家，整个过程中还有什么我可能注意不到的地方，
欢迎大家讨论！
谢谢大家！ |
b**********8
发帖数: 349 | 2 特别纳闷的是细胞能耐受puromycin，证明病毒应该是转进去了，可是为什么看不到一
点点的knockdown呢，求大神分析分析 |
s******y
发帖数: 28562 | 3
用的是同样的shRNA 以及同样的靶细胞来knock down 同样的蛋白么？
【在 b**********8 的大作中提到】
: 特别纳闷的是细胞能耐受puromycin，证明病毒应该是转进去了，可是为什么看不到一
: 点点的knockdown呢，求大神分析分析
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b******1
发帖数: 93 | 4 我们一般一个基因买五个shRNA,基本上两个可用， 两个没效果， 还有一个是反的。个
人觉得最好还是拿别人发表的序列用，几率高点。
【在 b**********8 的大作中提到】
: 这个问题快困扰我一年了，今天特意翻墙过来求助各位大大，
: 事情是这样的，之前在博士的实验室一直用pLKO.1-puro shRNA干扰基因表达，用的
: invitrogen的包装质粒（PLP1，PLP2和VSVG），在10cm的dish里面用HEK293FT转染，转
: 染用的是磷酸钙沉淀法，病毒上清用SBI的 precipitation solution（5x）浓缩，一直
: 都work well，偶尔偷懒奢侈一把用lipo2000转染，效率也是没得说。自去年博士毕业
: 回国后来到现在这个小实验室，当时雄心勃勃自信满满，打算自己包装慢病毒，用的还
: 是跟之前一样的质粒，细胞，只不过换到了T75的flask里面，用lipo2000转染（磷酸钙
: 转染法配buffer太烦，实验室pH计不准，老板对经费管的也很松，哈哈），之后用同样
: 的方法收病毒上清，浓缩。感染细胞后加puromycin筛选，染毒的细胞都能活下来，而
: 对照细胞48小时候就死光。可是收集细胞蛋白做WB却一点都看不到knockdown，前前后
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b**********8
发帖数: 349 | 5 是的，连抗体都是一样的
【在 s******y 的大作中提到】
:
: 用的是同样的shRNA 以及同样的靶细胞来knock down 同样的蛋白么？
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b**********8
发帖数: 349 | 6 是的，我们当初就是从openbiosystem买的，一共5个，经过验证有两个是有效的，在博
士老板的实验室用这两个做了很多数据，一直work的很好，但是换实验室后就不行了。
【在 b******1 的大作中提到】
: 我们一般一个基因买五个shRNA,基本上两个可用， 两个没效果， 还有一个是反的。个
: 人觉得最好还是拿别人发表的序列用，几率高点。
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f**********r
发帖数: 18251 | 7 转染小分子基因最有效的体系是MIT的那个体系，可以自己合成，很简单的
http://www.nature.com/nbt/journal/v26/n5/abs/nbt1402.html
【在 b**********8 的大作中提到】
: 这个问题快困扰我一年了，今天特意翻墙过来求助各位大大，
: 事情是这样的，之前在博士的实验室一直用pLKO.1-puro shRNA干扰基因表达，用的
: invitrogen的包装质粒（PLP1，PLP2和VSVG），在10cm的dish里面用HEK293FT转染，转
: 染用的是磷酸钙沉淀法，病毒上清用SBI的 precipitation solution（5x）浓缩，一直
: 都work well，偶尔偷懒奢侈一把用lipo2000转染，效率也是没得说。自去年博士毕业
: 回国后来到现在这个小实验室，当时雄心勃勃自信满满，打算自己包装慢病毒，用的还
: 是跟之前一样的质粒，细胞，只不过换到了T75的flask里面，用lipo2000转染（磷酸钙
: 转染法配buffer太烦，实验室pH计不准，老板对经费管的也很松，哈哈），之后用同样
: 的方法收病毒上清，浓缩。感染细胞后加puromycin筛选，染毒的细胞都能活下来，而
: 对照细胞48小时候就死光。可是收集细胞蛋白做WB却一点都看不到knockdown，前前后
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L****T
发帖数: 169 | 8 1，把shRNA质粒送去测一下序列（国内公司一般测不出来不收钱），很可能在你把质粒
带回国重新转化抽质粒过程搞混了。
2，另外，你puromycin杀了几天？有些shRNA筛选时间长了虽然细胞还耐受puromycin但
U6会被silence。
3，自己重新再做几个shRNA呗，国内引物合成便宜。 |
L****T
发帖数: 169 | 9 4，建议做个同时做RT-qPCR鉴定kd效果。因为不清楚你WB的band位置是否对。 |
b**********8
发帖数: 349 | 10 1,恩，好建议，我也打算这么做。
2，puromycin杀两天，未染毒的对照细胞全部死光光，染毒的细胞活的很好。
3，已经着手搞了，
谢谢你的建议！
【在 L****T 的大作中提到】
: 1，把shRNA质粒送去测一下序列（国内公司一般测不出来不收钱），很可能在你把质粒
: 带回国重新转化抽质粒过程搞混了。
: 2，另外，你puromycin杀了几天？有些shRNA筛选时间长了虽然细胞还耐受puromycin但
: U6会被silence。
: 3，自己重新再做几个shRNA呗，国内引物合成便宜。
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